אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתהליך גילוי סמים על איך תרופה ספציפית מתנהגת באורגניזם חי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הגדלים מדגם גדול להיות מוקרן במהירות וביעילות. טכניקה זו כבר יש השפעה גדולה בגילוי סמים על ידי הפעלת הערכה quanititative מאוד של ההשפעות של מועמדים לסמים.

שיטה זו מספקת תובנות מכניסטיות חדשניות על תחילתן והתקדמותן של מחלות לא דומות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות, כגון הזדקנות הקרנות גנטיות. אנחנו מאוד נרגשים מההזדמנות הזאת להכניס שיטות פיזיות חדשות למרחב של גילוי סמים.

שדים אלה של שיטה זו היא קריטית כמו שלבי ההקרנה דורשים היכרות גבוהה עם טכניקה אוטומטית זו נובו. הדגמת ההליך יהיה סם Casford, עוזר חיפוש מהמעבדה שלנו. לפני תחילת ההליך, להוסיף 2.2 מיליליטר של כל תרכובת סמים בריכוז המתאים שישה 5-fluorodeoxyuridine או לוחות FUDR לכל זן תולעת, על ידי הפצה בזהירות את המתחם על פני כל פני השטח של הצלחת, ולייבש את הצלחות בתנאים סטריליים.

בזמן שהצלחות מתייבשות, השתמשו ב-15 מיליליטר של חיץ M9 כדי לשטוף את התולעים מחמש צלחות עשירות של גורם גדילה נמטודה, ולהעביר את התולעים המשוחררות לצינור חרוטי לצנטריפוגה. להשעות מחדש את nematodes בשלושה מיליליטר של חיץ M9 טרי לכמת את מספר התולעים בשלב הזחל L4, וזרע 700 L4 זחלים על כל אחד מששת לוחות FUDR יבש לכל זן תולעת, לכל תרכובת. כאשר כל nematodes כבר זרעים, מניחים את הצלחות המכילות את הזנים שעבורם parlysis הוא המושרה על ידי העלאת הטמפרטורה ב 24 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.

למחרת, להדליק את אורות הבמה של גשש התולעת המקביל, ולנקות את שלב הזכוכית של הגשש עם 70 אחוז אתנול. אם לא נשאר שאריות נראות לעין, הסר את מכסה העדשה ולהשתמש באבק אוויר כדי לנקות את עדשת ההדמיה. ודא שהמצלמה מחוברת ומותקן כראוי והתחל להקליט באמצעות תוכנת לכידת התמונה.

כוונן את הגדרות המצלמה כדי להקליט 20 מסגרות לשנייה, עם הפרמטרים המתאימים להקלטת מונו-16. השתמש בצלחת פטרי ריקה באורך תשעה סנטימטרים כדי להבטיח שהבמה מוגדרת לגובה הנכון, ולהתאים את הבמה במידת הצורך. בתנאים סטריליים, להוסיף שלושה מיליליטר של פתרון M9 לצלחת הקרנה תנועתיות, ולהשתמש שני מיליליטר של פתרון M9 לשטוף שליש משטח הפנים של שתי לוחות FUDR טעון nematode מאותה קבוצת ניסוי לתוך צלחת ההקרנה.

לאחר מכן, מניחים את לוחית ההקרנה על בימת הגשש. השתמש בתולעת אחת כדי למקד את המצלמה, ולהתחיל להקליט את בעלי החיים. כאשר ההקלטה הושלמה, להשליך את צלחת תנועתיות, ולסמן את לוחות FUDR כמו בשימוש פעם אחת לפני החזרתם לאנקובטור.

כדי לנתח את נתוני הווידאו, פתח את ממשק המשתמש הגרפי של תוכנת ניתוח הנתונים של מעקב התולעת המקביל, ולהשתמש בפונקציית הגלישה כדי לטעון את הווידאו המעניין. בחר תיקיית יעד פלט ואשר כי 600 עד 1200 מסגרות מוגדרות לניתוח של 30 שניות. הכנס גורם המרה של 0.029 פיקסלים למילימטר להדמיה של צלחת פטרי ברזולוציה מלאה של תשעה סנטימטרים, ובחר את אלגוריתם המעקב המת.

תחת הכרטיסיה פרמטרי איתור, הגדר את תמונות Z-use ל- 100, את מרווח Z ל- 3, את הפיקסלים הסטנדרטיים ל- 54, את הסף ל- 9, את הפתח ל- 1 ואת הסגירה ל- 2. התאם את פרמטרי הסינון לגודל מינימלי של 20, גודל מרבי של 180 ותולעת בגודל 0.94. הגדר את הפרמטרים של מסלולי ההתגבשות לתזוזת מרחק מרבית של 10, אורך מינימלי של 150 וזיכרון של 10.

הגדר את פרמטרי הכיפוף והמהירות לסף סף כיפוף של 1.8, עיקול מינימלי של 0 ומסגרות להערכת מהירות של 150. כוונן את סטטיסטיקת התולעת המתה לקצב מרבי לדקה של 5, ומהירות מרבית של 1. בחר את תיקיית הפלט ובחר את מספר מסגרות הפלט ל- 50 ואת גודל הגופן ל- 10.

השתמש בפונקציה לדוגמה כדי לבדוק את הפרמטרים ולהפיק פלט של התמונות לדוגמה כדי לבדוק אם התולעים גלויות לאורך שמונת שלבי הסף. לאחר מכן ליזום את הפונקציה התחל משימה", ולשלב את התוצאות הבודדות עבור ערכת הנתונים כולה כדי לנתח את קבצי תוצאות הבדיקה, שמירת התוצאות באמצעות הייצוא לפונקציה TSV. שיטה זו מאפשרת אפיון של פנוטיפים נמטודה למחקרי אוכלוסייה גדולים של מודלים תולעת שונים של מחלה נוירודגנרטיבית, כגון דמנציה פרונטוטמפוראלית, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה צידית Amyotrophic.

כמו גם את האפיון של ההשפעות של מולקולות טיפוליות פוטנציאליות, באמצעות מודלים תולעת של פרקינסון ואלצהיימר. הדיוק הגבוה של מדידות אלה מושגת על ידי הגדלת מספר התולעים שניתן לנתח בהשוואה לשיטות מסורתיות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למזער את הזמן בין תוספת התולעים לתוהבות ותחילת המעקב.

בעקבות הליך זה, שיטות אחרות ניתן לבצע כדי להשלים את התוצאות כדי לקשר עם צבירת חלבון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות נוירודגנרטיביות ופלפול שגויות, כגון פרקינסון ואלצהיימר, כדי לחקור את יישומי הגילוי הנכונים. אל תשכח כי עבודה עם FUDR יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות, כגון לבישת כפפות ניטריל, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.