קציר ופיזור: צעד מתעלם במחקר שיטות ביופילם

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לקצור ולפרק ביופילמים בצורה האופטימלית כדי להגביר את הרבייה. שלוש טכניקות יודגמו בסרטון זה, שכל אחת מהן מתמקדת בקציר ובפירוק מסוג משטח אחר. וידאו זה ידגים את הטכניקות הנכונות עבור אחד, מערבולת ו sonicating biofilm את משטח קשה לא נקבובי כגון קופון פוליקרבונט מכור biofilm CDC.

שתיים, גירוד והומוגניזציה של הביופילם מעל משטח הזכוכית הקשה והלא נקבובי שנמצא בדרך כלל בכור זרימת הטפטוף. ושלוש, גירוד, מערבולת, ו sonicating של biofilm ממשטח צינורות סיליקון נקבובי נמצא בדרך כלל במודל קטטר. היי, שמי קלי בקינגהאם-מאייר כאן במעבדה לשיטות ביופילם מתוקננות.

במעבדה שלנו, אנו מפרקים שיטות ביופילם לארבעה מרכיבים: צמיחה, טיפול, דגימה וניתוח. בספרות ביקורת העמיתים, פרטים על האופן שבו נדגמים או נקטפים ביופילמים ומפורקים ממשטח הם בדרך כלל דלילים. זו הסיבה לסרטון הזה.

מכיוון שהמעבדה שלנו מפתחת ובודקת שיטות ביופילם סטנדרטיות, ערכנו סקירה ספרותית מקיפה שבה זוהו שלוש שיטות הקציר והפירוק הנפוצות ביותר של ביופילם. שיטות אלה הן מערבולת ו sonicating biofilm מקופון פוליקרבונט, גירוד הומוגניזציה biofilm מקופון זכוכית borosilicate, ו גירוד, מערבולת, ו sonicating biofilm מצינורות סיליקון. בעוד שיטות שנכתבו על נייר הן חזקות, אנו מקווים כי הווידאו עם הפרטים הטכניים שהוצגו על ידי עמיתתי לעבודה לינדזי מילר ואני יהיה מועיל.

כדי להתחיל, לגדול בוגר פסאודומונס aeruginosa 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E2562, שיטת הבדיקה הסטנדרטית לכימות של פסאודומונס aeruginosa Biofilm גדל עם גזירה גבוהה וזרימה רציפה באמצעות כור ביופילם CDC. בסוף תקופת הצמיחה של 48 שעות, היכונו לטפל ולדגום קופונים על פי תקן ASTM E2871, שיטת הבדיקה הסטנדרטית לקביעת יעילות חיטוי נגד ביופילם שגדל בכור הביופילם של ה- CDC באמצעות שיטת צינור יחיד. לאחר מכן הכנס באופן אספטי שומרי התזה משועבדים אוטומטית לצינורות חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים.

חזור על הפעולה עבור כל הצינורות שיקבלו טיפול. צינורות עבור תלושי בקרה לא צריך מגן התזה. הסר באופן אספטי מוט מכור הביופילם של ה-CDC ושטוף אותו ב-30 מיליליטר של מי דילול סטריליים.

זה יסיר את התאים המחוברים באופן רופף מהביופילם. החזק את המוט במקביל לספסל העליון מעל צינורות מדגם עם שומרי התזה. באמצעות מפתח ברגים אלן מעוקר להבה, לשחרר את הברגים להגדיר כדי להפיל קופון מצופה biofilm לתוך הצינור.

חזור על הפעולה עבור מספר הקופונים הרצוי. מוציאים את שומרי ההתזה ומניחים את שומרי ההתזה במיכל נפרד לעיקור. באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, לאט פיפטה ארבעה מיליליטר של טיפול או שליטה לתוך הצינורות, כך הנוזל זורם במורד החלק הפנימי של הקיר של הצינור.

מערבבים בעדינות את החלק התחתון של הצינור, כך שכל בועות אוויר מתחת לקופון נעקרו. אפשר 30 עד 60 שניות בין כל תוספת. בסוף זמן המגע שצוין, פיפטה 36 מיליליטר של מנטרל לתוך הצינורות באותו סדר שבו הטיפול או השליטה הוחלו.

מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 פלוס או מינוס חמש שניות ולהבטיח כי מערבולת מלאה מושגת. מניחים צינורות במתלה הצינורות התלויים בסוניאטור המנוטרל כך שמפלס המים באמבטיה שווה למפלס המים בצינורות. Sonicate הדגימות ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ותפקוד רגיל במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות.

חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולסיים עם מערבולת סופית, במשך חמישה מחזורים בסך הכל. לבסוף, לדלל באופן סדרתי את המדגם, צלחת הדילול על אגר R2A ודגור הצלחות במשך 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס. ספור את המושבות בהתאם לשיטת הציפוי ורשום את הנתונים.

זה הבא biofilm קציר וטכניקה פירוק שימושי עבור קופונים קשים שאינם נקבובי כי הם הסטנדרט בכור זרימת טפטוף. לגדול בוגר פסאודומונס aeruginosa 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E2647 שיטת הבדיקה הסטנדרטית לכימות של פסאודומונס aeruginosa Biofilm גדל באמצעות כור ביופילם זרימה טפטוף עם גזירה נמוכה וזרימה רציפה. הקימו את תחנת הדגימה כך שתכלול לוח דגימה, 95% אתנול בכוס, מבער אלכוהול, המוסטטים, כלי להסרת קופונים, כוסות עם מי דילול סטריליים וצינורות דילול לשטיפת הקופונים.

לכבות את המשאבה, להסיר את כיסוי הערוץ ולהשתמש בכלי להסרת קופונים סטריליים hemostats כדי להסיר את הקופון, נזהר לא להפריע biofilm. לשטוף את הקופון על ידי טבילה עדינה עם תנועת נוזלים ב 45 מיליליטר של מי דילול סטרילי הכלולים צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. מיד להפוך את התנועה כדי להסיר את הקופון.

מניחים את הקופון לתוך המכילה 45 מיליליטר של מי דילול סטריליים. לגרד את משטח הקופון מכוסה biofilm בכיוון כלפי מטה במשך כ 15 שניות באמצעות מרית סטרילית או מגרד. יש לשטוף את המרית או המגרדת על ידי ערבוב בכוס.

חזור על תהליך גירוד ושטיפה שלוש עד ארבע פעמים להבטיח כיסוי מלא של משטח הקופון. לשטוף את הקופון על ידי החזקתו בזווית של 60 מעלות על הכוס סטרילית וצינורות מיליליטר אחד של מי דילול סטריליים על פני השטח של הקופון. יש לחזור על הפעולה במשך חמש שטיפות בסך הכל.

הכרך האחרון בכוס הוא עכשיו 50 מיליליטר. עבודה בארון בטיחות ביולוגית, הומוגניזציה מדגם biofilm שרוט. צרף בדיקה הומוגנית סטרילית להומוגניזר.

מניחים את קצה הבדיקה בנוזל ומפעילים את ההומוגניזר ומשדרגים עד 20, 500 סל"ד. הומוגניזציה המדגם במשך 30 שניות. תנמיך את הסל"ד ותכבה את ההומוגניזר.

לחטא את הבדיקה בין דגימות ביופילם על ידי הומוגניזציה בדילול סטרילי תשעה מיליליטר ריק ב 20, 500 סל"ד במשך 30 שניות כמתואר לעיל. הומוגניזציה צינור תשעה מיליליטר של 70% אתנול במשך 30 שניות ולנתק את הגשוש ולתת לו לעמוד בצינור האתנול במשך דקה אחת. הומוגניזציה שני כדורי דילול נוספים.

כמו כן, בדיקה הומוגניזר חד פעמית סטרילית עשויה לשמש עבור כל דגימה. לדלל באופן סדרתי את המדגם הומוגני, צלחת את הדילול על R2A באמצעות שיטת הציפוי המתאימה, ודגור את הצלחות במשך 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס. לספור את המושבות ולתעד את הנתונים.

טכניקת קצירה ופירוק ביופילם סופית זו שימושית לביופילם הגדל בצינורות נקבוביים כמו צינורות הסיליקון המשמשים במודל הצנתר. כדי להתחיל הליך זה, לגדל biofilm E.coli בוגר 53498 בצנרת קטטר סיליקון. הכינו את חומרי הדגימה: צינורות שטופים, צינור צנטריפוגה סטרילי, צלחת פטרי סטרילית ריקה, המוסטטים מפלדת אל חלד מעוקרת להבה, מספריים, טיימר וסרגל.

עם המשאבה מושהית, השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלק החיצוני של הצינורות. מדוד שני סנטימטרים מהסוף, הימנעות מהשטח המחובר למחבר וסמן צינורות כדי לקבוע מיקומי חיתוך. עם מספריים מעוקרים להבה, לחתוך את הצינורות על סימן שני סנטימטרים.

יש לשטוף את מקטע הצינורות כדי להסיר תאים פלנקטוניים. עם מלקחיים מעוקרים בלהבות, יש לטבול בעדינות את מקטע הצינורות ב-20 מיליליטר של מי דילול סטריליים, ולאחר מכן להסיר מיד. מניחים את המקטע לתוך 10 מיליליטר של מנטרל.

עם מלקחיים מעוקרים להבה, להחזיק את קטע הצינורות ולגרד עם מקל אפליקטור עץ סטרילי עד שכל האזורים הפנימיים של הצינורות כבר גירדו. מדי פעם לשטוף את המקל ב 10 מיליליטר של מנטרל ולהניח את הקטע בחזרה לתוך צינור מדגם. קטע הצינורות המגרדים הוא כעת 10 בחזקת אפס או אפס דילול.

מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות. מניחים את הצינורות במתלה הצינורות התלויים באמבט sonicator, כך שמפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזלים בצינורות. Sonicate ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ותפקוד רגיל במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות.

חזור על מערבולת זו ומחזור sonication, ולאחר מכן לסיים עם המערבולת הסופית. לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על אגר סויה טריפטי באמצעות שיטת ציפוי מתאימה ולאחר מכן לדגור על הצינורות ב 36 פלוס או מינוס שתי מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.

ספור את המושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש ורשום את הנתונים כדי לחשב את הממוצע האריתמטי. ארבע התמונות שצולמו על ידי דניאל אור ובליין פריץ עוזרות להמחיש את החשיבות של הליך הקציר והפירוק הזה. כל ארבעת הקופונים האלה היו מוכתמים עם סגול קריסטל כדי לעזור לדמיין את כמות ביופילם פסאודומונס aeruginosa נוכח על הקופונים לפני ואחרי תהליך המערבולת sonication.

קופון A מכוסה לחלוטין ביופילם, בעוד קופונים B, C, ו- D כל יש הרבה פחות biofilm על פני השטח שלהם. קופונים B, C, ו- D היו כולם כפופים למערבולת ותהליך sonication שתואר בעבר. שתי התמונות שצולמו על ידי לינדסי מילר על מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 12.5 מתארות ביופילם פסאודומונס אירוגינוזה שטופל בכתם חי/מת באור האחורי.

התמונה משמאל הייתה sonicated ב 45 קילוהרץ ו 10% כוח, בעוד התמונה בצד ימין היה sonicated ב 45 קילוהרץ ו 100% כוח. ברור, הקופון בצד שמאל יש הרבה יותר biofilm נשאר על פני השטח שלה לעומת הקופון בצד ימין. נתון סופי זה מציג כיצד מניפולציה של פרמטרים שונים sonication משפיע על כמות ביופילם פסאודומונס aeruginosa הוסר מפני השטח קופון.

כל הקופונים האלה היו sonicated ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ועל הגדרה רגילה במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות. תמונות אלה צולמו בהגדלה פי 12.5 על ידי לינדסי מילר. קופונים בשורה אחת היו sonicated במי דילול, בעוד הקופונים בשורה השנייה היו sonicated במרק מנטרל DE.

נראה כי יש פחות biofilm שנותר על הקופונים שהיו sonicated במרק DE אשר מכיל פעילי שטח לעומת מי דילול. קופונים A, B, E, ו- F היו כל sonicated בנפח 10 מיליליטר, בעוד קופונים C, D, G ו- H היו sonicated ב 40 מיליליטר של פתרון. ברור שיש פחות biofilm על הקופונים אשר היו sonicated בכרכים הקטנים יותר.

קופונים A, C, E, ו- G היו sonicated באמבטיה עם שלושה צינורות בבת אחת, בעוד קופונים B, D, F, ו- H היו sonicated באמבטיה עם 12 צינורות בבת אחת. נראה כי הדגימות sonicated עם פחות צינורות הציגו קציר ביופילם מעולה. בסופו של דבר, מזעור הנפח בצינורות, הפחתת מספר הצינורות sonicated בבת אחת, ושימוש DE מנטרל מרק כל נראה לתרום קציר ביופילם משופרת.

אין שיטה מושלמת לקצור ולפרק את הביופילם, אבל כמה גישות טובות יותר עבור משטחים שונים ו / או יישומים. הטכניקות המודגמות בסרטון זה הן שלוש השיטות הנפוצות ביותר על פי סקירת ספרות. שלוש טכניקות אלה יכולות לספק נקודת התחלה לחוקרים.

חשוב לקחת את הזמן כדי לאמת את שיטת הקציר והפירוק שנבחרה. כל הציוד שונה במקצת, כך שגם אם השיטה תוקנה, עדיין זה נבון לאשר את התהליך עבור הציוד המשמש. מחקרים הוכיחו כי בחירות לא נכונות עלולות להוביל לתוצאות בדיקה מוטות.

לאחר צפייה בסרטון זה, מידע זה יסייע בתקווה לחוקרים לקבל החלטות מושכלות יותר באיזו שיטה להשתמש ולספק הדרכה על שיפור רבייה עבור שלושת סוגי פני השטח וטכניקות קציר ופירוק חינם.