בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

המשמעות של פרוטוקול זה היא לבחון את ההסתברות הגסה של אנטרואידים על מודל חוץ גופי של אפיתל מוקדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא למדוד את החדירות של לומן סגור המחקה את הסביבה הזוהרת של המעיים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את הגורמים הגורמים הגורמים למחלת המעי הדולף או מחלישים אותה.

זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אנדותל או כלי דם כדי לחקור תנאים שיכולים לגרום לדליפת כלי הדם. פרוטוקול זה דורש תרגול מסוים. אנו ממליצים לתרגל כל פרק בנפרד לפני שמחברים את כל ההליך יחד.

כדי להתחיל, העבירו את מקטעי המעיים לצלחת פטרי בגודל 60 על 15 מ"ר עם PBS קר כקרח של דולבקו עם אמפוטרצין והשרו במשך 20 דקות על קרח. בעזרת אזמל עם זוג מספריים, חותכים את מקטעי המעי לשלושה עד חמישה מילימטרים ומניחים חתיכה אחת עד שתיים בצלחת פטרי בגודל 35 על 15 מילימטר מרובע המכילה 0.5 עד מיליליטר אחד של מדיום גידול אורגנואידי על קרח. חותכים את צינור המעי לאורך באמצעות מיקרו-מספריים ומלקחיים.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לגרד את תאי האפיתל מן החיתולית. מוציאים את החיתולית ומערבבים את המנה כדי לשבור את גושי התאים. לאחר מכן, באמצעות קצה חיתוך פיפטה של 20 מיקרוליטר, העבר את התאים ואת המדיה במרווחים של חמישה עד 10 מיקרוליטרים לתערובת מטריצת קרום מרתף כדי ליצור תמיסה של 285 מיקרוליטר.

מערבבים את התאים על ידי פיפטינג במטריצת קרום מרתף על קרח באמצעות קצה חתך של 200 מיקרוליטר. לאחר הערבוב, הניחו חמש רצועות של 50 מיקרוליטר של תערובת מטריצת קרום מרתף התא בבאר אחת של צלחת שש בארות שחוממה מראש שנשמרה על לבנה קצף חמה. יש לדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 דקות כדי לאפשר פילמור והתקשות של מטריצת קרום המרתף.

לאחר שרצועות המטריצה מתמצקות, מוסיפים שני מיליליטר של מדיית הצמיחה האנטרואידית לתוך הבאר לפני שמחזירים את הצלחת לאינקובטור. לאחר העברת האנטרואידים לבאר של צלחת של שש בארות או 12 בארות, כל יום חלופי, להחליף את המדיה הישנה עם מדיה רעננה. וכאשר האנטרואידים החלו לשגשג, העבירו את התאים כל חמישה עד שבעה ימים.

עבור צביעה אימונופלואורסצנטית, יש להוסיף 500 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי בחסימת חיץ לכל באר של אנטרואידים ולדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את פתרון הנוגדנים ולשטוף את enteroids שלוש פעמים עם PBS. לאחר דגירה בתמיסת נוגדנים משנית מדוללת אחת עד 400, ולאחר מכן דגירה ב- DAPI, יש לשטוף את האנטרואידים שלוש פעמים עם PBS.

כדי לשמר את המבנים התלת-ממדיים של האנטרואידים, השתמש במגזרות של יריעות גומי סיליקון דקות או החלקות כיסוי זכוכית כדי ליצור רווח של 0.5 עד מילימטר בין מגלשת הזכוכית התחתונה למחליק הכיסוי. להרכבה, יש לשטוף את האנטרואידים המוכתמים ב-70% גליצרול. לאחר מכן, באמצעות לולאת חיסון של מיקרוליטר אחד, או קצה חתך של 200 מיקרוליטר, הרימו את האנטרואידים מהצלחת והרכיבו עם גליצרול על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית.

הכינו צלחת פטרי מכוסה בכיסוי סרט שקוף והוסיפו שתיים עד ארבע טיפות של מיקרוליטר אחד של הדקסטרן-FITC על הסרט. באמצעות המיקרו-מניפולטור, הניע את קצה המיקרו-פיפטה בתוך הנוזל ומעל הסרט תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולאחר מכן משוך בעדינות את המזרק כדי למשוך את הדקסטרן-FITC לתוך המיקרו-פיפטה. לאחר מילוי המיקרו פיפטה בשניים עד ארבעה מיקרוליטרים של Dextran-FITC, דחפו את המזרק כדי להסיר אוויר מקצה הפיפטה.

כמו כן, בדוק את עמודת החומר המוזרק במיקרו פיפטה כדי לוודא שאין כיס אוויר ולרשום את נפח Dextran-FITC בתוך המיקרו פיפטה. לאחר מכן, הפעל את מקור האוויר המחובר למשאבה הפנאומטית לפני הפעלת המשאבה והגדרת משך המשאבה ל -10 עד 15 אלפיות השנייה. לאחר מכן סובבו את הפקק על המזרק כדי לפתוח את הקו מהמשאבה למיקרו פיפטה.

הסר את האנטרואידים מהאינקובטור והנח את המנה על לבנה קצף חמה במיכל מכוסה כדי למזער את החשיפה לאור לאחר מיקרו הזרקה. הניחו את צלחת הפטרי עם האנטרוידים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והזיזו את ידיות המיקרו-מניפולטור כדי למקם את קצה המיקרו-פיפטה בזווית של 35 עד 45 מעלות אל המשטח האופקי. דמיינו וזיהו את האנטרואידים הכדוריים במטרה להזריק שלושה עד חמישה אנטרואידים לכל מנה.

לאחר מכן, קדם את הקצה לאנטרואיד מטרה על ידי התבוננות דרך חתיכות העין של המיקרוסקופ. לאחר מכן, קידום ידית ציר Z בתנועה איטית מדויקת, לנקב את האנטרואיד עם קצה מיקרו פיפטה. ההתקדמות צריכה להיפסק ברגע שהקצה עובר דרך המשטח האנטרואידי, אשר מדכא וקופץ בחזרה.

הקש על דוושת המשאבה ברגל אחת ומלא את האנטרואיד בתמיסת Dextran-FITC הירקרק עד להרחבה. רשום את מספר המשאבות כדי לחשב את נפח השאיבה ואת ריכוז הדקסטרן. פרוטוקול זה הראה את האפיון של אנטרואידים שמקורם ברקמות עובריות על ידי צביעת סמנים ביולוגיים שונים ספציפיים לאפיתל המעי בנוגדנים אימונופלואורסצנטיים, המאשרים את מקורם באפיתל המעי הדק.

אנטרואידים בשלבים שונים מוצגים כאן. אנטרואיד בן שבעה עד עשרה ימים הוא קטן ועבה. ואילו אנטרואיד מוכן למיקרו-הזרקה היה גדול עם לומן וקיר דק.

האנטרואיד יומיים לאחר הזרקת מיקרו עדיין מכיל כמויות משמעותיות של Dextran-FITC. החדירות של האנטרואידים לאחר מיקרו הזרקה הוערכה על ידי מדידת ריכוז Dextran בתקשורת. EGTA, הידוע כמגביר את חדירות הממברנה בצמתים הדוקים, שימש כבקרה חיובית.

בדיקת המדידה של דקסטרן מראה עוד כי LPS גרם לחדירות מוגברת וריכוז LPS גבוה יותר גרם לחדירות גבוהה יותר. הדבר החשוב ביותר על תיקון והכתמה היא לא לשבש את הצורה של enteroids או לאבד אותם במהלך התהליך. לאחר הזרקת מיקרו, ניתן לאסוף מדיה לבדיקת ציטוקינים וניתן לקצור אנטרואידים לריצוף RNA.