הכנת מורסה מיקובקטריום משובצת חרוז אגר לחיסון עכברים בעלי יכולת חיסונית תוך קנה הנשימה

אנו מפתחים מודל עכברי של זיהום ריאות כרוני של מורסות מיקובקטריום כדי לבחון את יעילות האנטיביוטיקה במחקרים פרה-קליניים. האתגר הראשון הוא להתגבר על העמידות הפנימית של עכברים למורסות מיקובקטריום. האתגר השני הוא לייצר אצווה ניתנת לשחזור של חיידקים משובצים בפעימות אגר לזיהום תוך-קנה הנשימה. אנו רוצים לחלוק פרוטוקול מפורט של הכנת פעימות אגר וזיהום שניתן ליישם בקלות על ידי מעבדות אחרות לבדיקת תרופות חדשות בעכברים.

הדבקה בחיידקים משובצים במקום חיידקים חופשיים, מתגברת חלקית על יכולתם של עכברים בעלי יכולת חיסונית לנקות את הזיהום באופן ספונטני. מודל זה מספק כלי פרה-קליני חזק להערכת אנטיביוטיקה חדשה כנגד Mycobacterium abscessus, ומקל על גילוי ופיתוח של אנטיביוטיקה נחוצה מאוד נגד זיהומים ריאתיים.

[מדריך] כדי להתחיל, השג תרביות תרחיף Mycobacterium abscessus הגדלות באופן אקספוננציאלי המותאמות לצפיפות אופטית של 30. העבירו 27 מיליליטר של מקדחת סויה טריפטיכון מותכת מאוזנת מראש ב-50 מעלות צלזיוס לתוך צינור המכיל שלושה מיליליטר של תרחיף חיידקים. מערבבים את המתלה על ידי פיפטינג. פיפטה בזהירות את תערובת מקדחת החיידקים לבקבוק המכיל 60 מיליליטר שמן מינרלי בבקבוק. מניחים את הבקבוק בכלי משני ומיד מתחילים לערבב במהירות בינונית על ערבוב מגנטי בעזרת מוט ערבוב מגנטי. ודא שנוצרת מערבולת גלויה בתערובת מקדחת השמן והמשיך לערבב במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. מניחים קרח במיכל המשני כדי לאפשר לתרחיף להתקרר. לאחר מכן העבירו את תערובת השפכים לצינורות צנטריפוגה של 250 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלה ב-3,700 G למשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס בחמשת המחזורים הראשונים, והשעיה מחדש של גלולת חרוז המקדחה עם DPBS. כמו כן, הרכיבו מסננת תאי משפך, טבעת מחבר וצינור של 50 מיליליטר ליחידה אחת. לאחר הכביסה העשירית, השעו מחדש את הכדור ודללו את מתלה החרוזים ארבע פעמים. הוסף את חומר הדגימה המדולל על המסננת כדי לסנן את מתלה החרוזים. לאט, משוך את הבוכנה של מזרק 30 מיליליטר המחובר לטבעת המחבר כדי ליצור יניקה ולשפר את הסינון. לאחר מכן צנטריפוגה את המתלה המדולל ב -1000 גרם למשך שתי דקות כדי לרכז אותו. לאחר משיכת כדורי החרוזים לצינור של 50 מיליליטר, אחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע, אך הכין חרוזים טריים לכל אצווה של ניסויים. כדי להתחיל, רסנו עכברי CD 1 מרדימים באמצעות מעמד תלת מימדי מעוצב בהתאמה אישית, מודפס ומוטה. אבטח את העכבר בחותכותיו באמצעות חוט תפר המחובר למוט המרכזי של המעמד. הצבת העכבר בתנוחת שכיבה גחונית כשראשו מורם. חבר מחט מתכת להאכלת בעלי חיים בגודל 24 למזרק זכוכית מלא בתרחיף חרוז מקדחה Mycobacterium abscessus. הנח קליפסים או פקקים מניילון על הבוכנה כדי להבטיח נפח חיסון מבוקר של 50 מיקרוליטר לעכבר. כעת, מקם את מחט המתכת אנכית מעל העכבר. הכנס בזהירות את המחט בחלק העליון והחלק אותה הלאה למטה לתוך קנה הנשימה. הסר את קליפ הניילון או הפקק והוציא לאט לאט 50 מיקרוליטר של תרחיף חרוזי מקדחה Mycobacterium abscessus לריאות. תן לעכבר לנוח חמש דקות. לאחר מכן חזור על הליך החיסון פעם נוספת כדי להבטיח שקיעה עמוקה וניתנת לשחזור של החיסון המלא לריאות. חרוזי מקדחה המכילים Mycobacterium abscessus ביטאו חלבון פלואורסצנטי אדום דובדבן וגודלם נע בין 70 ל -250 מיקרומטר. עומס החיידקים על פני שישה תכשירי חרוזים עצמאיים הראה יכולת שחזור גבוהה. ספירת חיידקים לפני ואחרי המעבר דרך מזרק הזכוכית לא הראתה אובדן משמעותי של עומס החיידקים. שיטת החיסון הבין-קנה הייתה ניתנת לשחזור על פני שלושה תכשירי חרוזים עצמאיים כפי שהוצג על ידי ספירת CFU של הריאות 24 שעות לאחר ההדבקה. יכולת שחזור ההדבקה בין שלושה מפעילים עצמאיים אושרה מכיוון שספירת CFU של הריאות ב-24 שעות לאחר ההדבקה נותרה עקבית בכל הקבוצות.