שיטה אופטימלית לגידול והגדלה ביולוגית מיקרוביאלית של Typha latifolia (זנב חתול)

העבודה שלנו מתמודדת עם המחסור בפרוטוקולים לגידול קטיילים מזרעים. פיתחנו שיטות שכפוליות לנביטת זרעים, צמיחה מוקדמת והרחבת ביולוגיה מיקרוביאלית לתמיכה במחקר עתידי של מיקרובים בצמחים. מעט מחקרים מגדלים זנב חתול מהזרעים או עוקבים אחריו עד לבשלותו, אך זנבות חתולים משמשים לעיתים קרובות במחקר שיקום ביצות.

רוב מחקרי הזנבות כוללים רכישת ריזומים להתרבות של קנביות במחקרים במעבדה. מעט מחקרים מגדלים קטייל מזרעים, ולכן אין שיטות סטנדרטיות. השגת נביטה עקבית והתיישבות מתמשכת של מיקרובים שהובאו הייתה אתגר משמעותי.

פיתחנו שיטות ניתנות לשחזור לנביטת זרעים ולהגברת ביולוגיה מיקרוביאלית, המדגימות כיצד חיסון מוקדם מסייע בתמיכה בהתיישבות ארוכת טווח. כדי להתחיל, השתמש במספרי גינה כדי לגזום את גבעול צמח Typha latifolia כ-2 סנטימטרים מבסיס התפרחת. משכו את הזרעים מהתפרחת, העבירו את הזרע לבלנדר מעבדה עד שהבלנדר מלא בערך רבע, כלומר כ-250 מיליליטר של זרעים לא דחוסים.

כעת מלאו את הבלנדר ב-500 מיליליטר של מי ברז, כדי להבטיח שמירה על מרווח ראש של 10 סנטימטרים. ערבבו את התערובת במהירות בינונית נמוכה למשך 20 שניות, ומיד העבירו את התוכן הצמיגי לבקבוק של ליטר אחד. העבר כ-100 מיליליטר מתערובת מי הזרעים חזרה לבלנדר.

לאחר מכן הוסיפו 400 עד 600 מיליליטר של מי ברז טריים וערבבו במהירות בינונית גבוהה למשך 20 שניות. שפכו את התכולה לבקבוק חדש בנפח ליטר אחד. עכשיו מלא את הבקבוק במי ברז עד 800 מיליליטר.

לאחר שהשארתם ל-60 שניות, הסרו את הבוץ הצף מלמעלה מבלי להפריע לזרעים שהתיישבו בתחתית. שפכו לאט את שארית המים והעבירו את הזרעים לבקבוק של 100 מיליטר. חזור על תהליך הערבוב עבור הבוץ המים שנותר מהזרעים. לאחר מכן מניחים את הבקבוק המכיל את הזרעים המופרדים על צלחת ערבוב.

לאחר הערבוב, הסר כל חומר צמח צף מפני הכוס. שפכו את הזרעים למשפך בוכנר עם נייר סינון שמחובר לוואקום ותנו להם להתייבש כל הלילה. אחסן את הזרעים היבשים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בצינורות פוליפרופילן קוני בנפח 50 מיליליטר.

הכינו לוחות מדיה של מורשייג וסקוג בחצי עוצמה עם 1% פיטו אגר. העבר כמיליגרם אחד מהזרעים היבשים לצינור פוליפרופילן קוני בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר מים טריליים ומזוקקים כפול לצינור.

הניחו את הצינור על רעידת מסלול במהירות בינונית גבוהה למשך 10 דקות. כעת הוציאו את המים מהצינור והוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת 0.1% פוליסורבט 20 שהוכנה במים סטריליים כפולים מזוקקים. נער את הצינור במהירות בינונית וגבוהה במשך 10 דקות.

הסר את תמיסת פוליסורבט 20. בצע את כל השלבים הבאים מול מכסה זרימה למינרי. החליפו את התמיסה בחמישה מיליליטר של 30% אקונומיקה מסחרית ותמיסה של 0.025% פוליסורבט 20 שהוכנה במים סטריליים ומזוקקים כפול.

החליפו את הסופרנטנט במים מזוקקים כפולים סטריליים. אחר כך נער את הצינור במהירות בינונית גבוהה במשך חמש דקות. לאחר השטיפה השלישית, סובבו את הצינור במהירות נמוכה במשך 24 שעות כדי לעורר נביטה.

למחרת, הסר את עודפי המים וודא שנשארים שלושה מיליליטרים של נוזל בצינור. עכשיו, באופן לא מדויק, חתוך את קצה קצה פיפטה מפלסטיק בנפח 1000 מיקרוליטר. השתמש בקצה הפיפטה החתוך כדי פיפט חזק ותליית את הזרעים בתוך הקצה.

הגש את הזרעים והנוזל לצלחות מורשייג וסקוג אגר עם חצי חוזק. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את הזרעים באופן שווה. עטוף את הלוחות בסרט איטום מעבדתי, ואז הנח אותם בתא גדילה עם מחזור אור של 16 שעות ומחזור חושך של 8 שעות בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס ו-70% לחות.

כדי לחסן את זרעי הזנב, יש לחטא זרעים עם אקונומיקה פוליסורבט 20 ומים מזוקקים כפולים, כפי שהודגם. מדדו את הצפיפות האופטית של תרבית לילה של לוטיימונאס מבודדת ב-600 ננומטר. נרמל את התרבות לערך ספיגה של 1.0 על ידי דילול במדיום התרבית.

עכשיו צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית ב-9,300 גרם לשתי דקות. הסר את הסופרנטנט ותשהה את הכדור במיליליטר אחד של PBS. לאחר הצנטריפוגה והסרת הסופרנטנט שוב, החזירו את הכדור החיידקי למיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים סטריליים.

השתמש בזרעים מחוטאים, ואז דילל את החיסון בדילול של אחד עד עשר עם 0.025% אורגנוסיליקון סורפקטנט באותו צינור. נער את המתלה במהירות נמוכה במשך 24 שעות לפני הנביטה. התחילו במילוי יחידת תא צמיחה סטרילי באדמה מועדפת שנרטבה מראש במי ברז.

כסו את קצה הנעילה של Luer בנייר אלומיניום והחלו אוטוקלב על מחזור נוזלי למשך 20 דקות. לאחר מכן, בתנאים סטריליים, מחברים יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר למחבר Luer Lock בתא הגידול. פתח את החדר והוסיף 500 מיקרוליטר של פילטר מחוטא במידה 1% על 20 על 20 לאדמה.

ערבבו את האדמה עם מרית סטרילית ובמקביל מוסיפים מים מזוקקים כפולים סטריליים כדי לשמור על הידרציה מבלי להוציא את האדמה לרוויה יתר על המידה. עכשיו, השתמש בלהב גילוח סטרילי כדי לחתוך את מורשיגה ואגר סקוג מפלטות עם שתיל ישן וחלש לרבעים. בעזרת מרית סטרילית, העבר חתך אגר אחד עם שתיל אל הקרקע המוכנה בתא הצמיחה.

העבר את יחידת תא הגידול לאינקובטור צמיחה עם מחזור אור של 16 שעות ו-8 שעות חושך בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס ו-70% לחות. צלקת מלאה של זרעי טיפה הובילה להפרדה נראית לעין של רכיבי זרעים, בעוד שצלקות לא שלמות השאירה את המקור מחובר והזרעים שלא הוצרצו נשארו שלמים. המערכת ההידרופונית הסטרילית הוכחה כתומכת בצמיחת מיני קטייל וג'ונקוס, המוצג כאן כג'ונקוס, שנשמר בתוך המערכת הסטרילית עד שנה.

קצב הנביטה הגבוה ביותר של זרעים – 20.8% נצפה בשיטת 30% אקונומיקה ופוליסורבט 20, שהייתה גבוהה משמעותית מכל טיפולי העיקור האחרים למעט שיטת גז הכלור של שעה שלא הצליחה להשיג עיקור מלא של זרעים. שבעה ימים לאחר הצלקות, שתילי טיפה הנובטים פיתחו רדיקלים נראים ורקמת נצרים בסביבה של לוח פטרי לא סטרילי. לאחר ההשתלה לאדמה, תת-קבוצה של שתילי טיפה התבססה בהצלחה וייצרה רקמת נצרים חדשה בתוך שבוע עד שבועיים.

לאחר החיסון עם מיני Luteimonas הנושאים פלסמיד DsRed, נצפתה התיישבות חיידקים פלואורסצנטיים אדומים לאורך שורשי שתיל Typha 16 ימים לאחר החיסון.