מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

העבודה שלנו ממפה אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות ישירות מתאים ורקמות מקומיות, וחושפת כיצד מחלה מחברת מחדש רשתות תאיות. בניגוד לרוב השיטות הבין-אטומיות, dfPPI אינו דורש הנדסה גנטית וכישורים מקבוצות המטופלים, תוך שימוש בלכידת מולטיפלקס אחת לכל דגימה. כדי להתחיל, יש להכין בופר חילוץ חלבון המכיל 20 מילימולר טריס, 20 מילימולר אשלגן כלוריד, 5 מילימולר מגנזיום כלוריד, ו-0.01% Nb-40.

הוסיפו מעכבי פרוטאז ופוספטאז מיד לפני השימוש ושמרו על הבופר על הקרח. הכניסו את דגימת הרקמה הקפואה לצינור הומוגניזר מיקרו-רקמות המצויד בעלי. הוסיפו 500-700 מיקרוליטר של בופר הליזה הטבעי, תוך התאמת הנפח בהתאם לקומפקטיות הרקמה וקלות ההומוגניזציה.

לאחר מכן, הומוגניזציה של הדגימה על הקרח על ידי הזזת עדינות של העלי למעלה ולמטה ונגד דפנות השוחק עד שמתקבל תלייה אחידה. דגרו את הליזאטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על ידי הנחת הבקבוקון על יחידת סיבוב. ערבבו בעדינות את הדגימות במהלך הדגירה באמצעות סיבוב.

באמצעות צנטריפוגה על שולחן, בצנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 13,000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. אספו בזהירות את הסופרנטנטים והעבירו אותם לצינורות מיקרוצנטריפוגה שקופים בנפח 1.5 מיליליטר. קבעו את ריכוז החלבון הכולל בסופרנטנט באמצעות ערכת הבדיקה BCA לפי הוראות היצרן.

לאחר מכן, קח אליקו של חרוזי פוליאוריתן ישירות ממאגר האיזופרופנול. תן לחרוזים לשקוע כדי להסיר את ממס האחסון. שאפו בזהירות את האיזופרופנול, הוסיפו בופר ליזיס טבעי והחזירו את החרוזים לחלוטין באמצעות פיפטינג עדין או היפוך.

כדי לשטוף ולאזן את החרוזים, יש לסחרר את הצינור ואז לצנטריפוגה. לאחר מכן, שאיפו את הסופרנטנט באמצעות קו ואקום עם קצה פיפטה, תוך זהירות שלא להפריע לכדור. הוסיפו בופר קישור לחרוזים השטופים ביחס שווה ליצירת תערובת חרוזים אחידה.

אליקווט 40 מיקרוליטרים של תערובת חרוזים מפוליאוריתן לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, תוך שימוש בקצה פיפטה חתוך להזרקה חלקה. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם בופר ליזיס טבעי על ידי הוספת 1 מיליליטר של בופר לכל צינור. מפעילים את הצינור כדי להחזיר את החרוזים, ואז צנטריפוגה ב-10,000 G למשך דקה אחת ולזרוק את הסופרנטנט בשאיבה.

לאחר הכביסה הסופית, הסר את רוב הנוזל שנותר מהצינורות, כדי לוודא שהכדור החרוזי נשאר ללא הפרעה. הוסיפו את תמציות החלבון המנורמליות לצינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מיליליטר המכילים 40 מיקרוליטר של תערובת חרוזי בקרה. כוון את הנפח הסופי ל-250 מיקרוליטר על ידי הוספת כמות מתאימה של בופר ליזיס טבעי.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם סיבוב על רוטטור קצה על קצה הפועל במהירות של 10-15 סיבובים בדקה. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 10,000 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לפלוט את חרוזי הבקרה יחד עם חלבונים מצטברים או בלתי מסיסים. אסוף בזהירות את הסופרנטנט מחרוזי הבקרה באמצעות פיפטה בנפח 1 מיליליטר והעבר אותו לצינורות טריים בנפח 1.5 מיליליטר המכילים 40 מיקרוליטר של תערובת פוליאוריתן שטופה.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות עם סיבוב על רוטטור קצה על קצה. לאחר צנטריפוגה זהירה של הצינורות, שאפו את הסופרנטנט ושוטפים את החרוזים ארבע פעמים, כפי שהודגם קודם. הסר כל שאריות PBS מהצינור.

החזירו את החרוזים השטופים ב-80 מיקרוליטר של אוריאה 2 מולר שהוכנו טרי בביקרבונט אמוניום 50 מילימולר ב-pH 8.5 באמצעות פיפטינג או מערבולת קצרה. לאחר מכן, מוסיפים דיתיותרייטול כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מילימולר. לאחר סגירת הצינור, יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור בקצב של 1,100 סיבובים לדקה על מטלטל אורביטלי מחומם.

הוסיפו יודואצטמיד כדי להגיע לריכוז סופי של 3.67 מילימולר. דגר את הצינורות בחושך בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות עם ניעור במהירות של 1,100 סיבובים בדקה. כעת, הוסיפו דיתיותרייטול נוסף כדי לכבות כל יודואצטמיד שלא הגיב, כדי להבטיח ריכוז סופי של 3.67 מילימולר ולערבב בעדינות באמצעות פיפטינג.

הוסף לדגימה 750 ננוגרם של 0.5 מיליגרם של פרוטאז Lys-C בדרגת ספקטרומטריית מסה למיליליטר. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ניעור במהירות של 1,150 סיבובים בדקה. לאחר מכן, הוסף לדגימה 750 ננוגרם של טריפסין טרי של 0.5 מיליגרם למיליליטר בדרגת ריצוף.

דגרו את התערובת לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 1,150 סיבובים בדקה. ביום הבא, צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 1,000-5,000 גרם למשך 1-5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר בזהירות את הסופרנאנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה, והשליך את החרוזים.

כוונו את ה-pH של העיכול מתחת ל-3 על ידי הוספת 50% חומצה טריפלואורואצטית בדרך. אמת את ה-pH באמצעות רצועות אינדיקטור. חרוזי PU קלטו בחוזקה את HSP90, HSC70 וחלבונים חמים מהאפיכפרום עם ליזאט גבוה עם אות מינימלי מהאפיכפרום לוזאט נמוך, מה שמאשר את הספציפיות הביולוגית של הגלאי.

פרופיל המטען של חרוזי ה-PU הראה אות עשיר וגבוה במשקל מולקולרי בנתיב חרוזי ה-PU ורקע מינימלי בנתיב החרוזים, מה שמאשר פעילות מוצלחת של הגשושית. ג'לים SDS-PAGE צבועים בקומאסי הראו התפלגות רצועה עקבית בארבע דגימות מעובדות בג'ל, מה שאישר העשרה מוצלחת של קומפלקסים חלבונים מליזטים מקומיים לפני ספקטרומטריית מסה. השחזוריות הטכנית אושרה על ידי ניתוח רכיבים עיקריים, כאשר דגימות שכפולות התקבצו בצפיפות בעוד דגימות שונות נפרדו בצורה נקייה.

התפלגויות עוצמת יונים מקדימוניות הראו שרוב המאפיינים היו בעלי מקדמי שונות מתחת ל-20% עם ערכים חציוניים בין 9.7% ל-11.9% על פני המדגמים, מה שמאשר זיהוי והתאוששות עקביים של פפטידים. קיבוץ היררכי של שפע חלבונים שעברו לוגרימטריתם חשף הפרדה חזקה של דגימות ושונות בין-דגימות נשמרת, כאשר עוצמות חלבון שנעות בין שפע נמוך לחלבונים מועשרים מאוד. ניתוח העשרת מסלולים הראה כיסוי רחב של הערות על פני מספר אונטולוגיות, כולל קטגוריות אונטולוגיית גנים ומאגרי מידע מאוצרים, כגון Reactome, KEGG ו-WikiPathways.

dfPPI אפשר לנו לחשוף תובנות מכניות וטיפוליות שגישות אחרות פשוט אינן יכולות להגיע אליהן. dfPPI מביא את האינטרומיקה לרמה של קבוצות מחלות אמיתיות ומצבים מקומיים, ומאפשר השערות מכניות וטיפוליות מדויקות. כעת אנו מרחיבים את dfPPI כדי למפות שינויים ברמת הרשת במחלות ניווניות עצבית, כמו אלצהיימר ופרקינסון.