מודל רב-מעבדתי רשת ההערכה הפרה-קלינית לשבץ מוחי עם תרומבליזה: TE-MCAo

היקף המחקר שלנו הוא לפתח מודל שבץ טרומבואמבולי עם תרומבליזה מבוקרת לשימוש בבדיקות טיפוליות פרה-קליניות רב-מעבדתיות קפדניות. הפרוטוקול שלנו מתמודד עם היעדר מודל שבץ טרומבואמבולי פשוט שניתן לשחזור המדמה תרומבליזה קלינית ותומך בניסויים פרה-קליניים רב-מרכזיים. כדי להתחיל לרנדר צינור PE-50 קהה על ידי חיתוך הקצה בזווית משופעת.

גזום את קצה נקודת השיפוע באמצעות מיקרו-מספריים. לאחר הכנת העכברוש המורדם לניתוח, יש לבצע חתך אנכי בירך הפנימית, באורך של כ-1.5 עד שני סנטימטרים לאורך הקפל הטבעי של החיתוך המפשעי עם הרגל. החתך צריך להיות אורתוגונלי למסלול האנטומי הצפוי של עורק הירך.

באמצעות ניתוח קהה, נתח בזהירות עד כלי הירך. לאחר מכן מפריד את העורק הירך מהווריד והעצב שעוברים באותו חבילה. שלד את העורק הפמורלי ככל האפשר קרוב יותר, ועקב אחרי העורק עד למקורו הרטרופריטוניאלי.

מניחים באופן רופף לולאה של משי 5-0 סביב עורק הירך, והשתמשו בזנבות כדי לספק מתיחה עדינה בקצה הפרוקסימלי של העורק. לאחר מכן, חסימו את עורק הירך בדיסטל עם רצועת משי 5-0, והשתמשו בזנבות התפר כדי לספק מתח קל מרחוק באמצעות מהדקים המוסטטיים. כשני שלישים מהמרחק מלולאת התפר הפרוקסימלית, מניחים חתיכת תפר משי מתחת לעורק ויוצרים ארטריוטומיה קטנה רחוקה לתפר הרופף באמצעות מספריים מיקרו.

באמצעות מלקחיים חדים, הרימו את הפתח העליון של העורקים והכניסו את קטטר PE-50 הקהה לפתח. קדימו את הקטטר קרוב ככל האפשר, כך שהלולאה הרופפת, כאשר היא מתהדקת, תקיף את הקטטר. הדק את התפר בעדינות, כדי לוודא שהוא לא חוסם את הקטטר או יושב על המדרון.

שחרר את מהדק הנעליים הגומי. הקטטר אמור להתמלא מיד בדם. מלאו שלושה צינורות צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מילוי הצינורות, הסר את קטטר PE-50 מהעורק הירך, קשור את הקצה הפרוקסימלי, וסגר את החתך עם תפרי פרולן 5-0 שנקטעו. כדי להכין את הקרישה, העבר 500 מיקרוליטר של דם תורם טרי או מאוחסן לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, והוסיף מיליליטר אחד של כלוריד סידן להפיכת נוגדי קרישה. לאחר מכן שאיפת הדם מצינור המיקרוצנטריפוגה לצינור PE-50 בקוטר 100 סנטימטר, באמצעות יניקה עדינה, ודוגרת את הצינור המפותל ב-PBS מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בתנור שולחני.

לאחר שהוצאתם את הטרומבוס לצלחת פטרי המכילה PBS, חתכו אותו לחלקים של כ-6 סנטימטרים באמצעות להב גילוח. משוך כל קרישה בעדינות לתוך קטטר PE-50 ושחרר אותו חמש פעמים כדי לשטוף אותו. שטוף את הטרומבוס שוב על ידי משיכתו בעדינות לקטטר PE-10 והוצאת אותו 15 פעמים במלואו.

הוסף 200 מיקרוליטר של 4% אוונס כחול לצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר PBS כדי ליצור דילול מספר 1. לאחר מכן פיפטה של 400 מיקרוליטר של דילול מספר 1 לתוך צלחת פטרי נפרדת המכילה 20 מיליליטר PBS ליצירת דילול מספר 2. הניחו את הקריש בתמיסת פטרי הכחולה המרוכזת יותר של אבנס לשנייה, ואז העבירו אותו לצלחת פטרי הכחולה המדוללת.

טעין אחד ששטף את הזרם למיקרוקטטרים מוכנים מראש ללא תסחיף אוויר, באמצעות שיטת רטוב-רטוב. לאחר שהקרם מלא, הוציא מספיק קרם כדי שיישאר בדיוק חמישה סנטימטרים במיקרוקטטר. גזום את העודף עם להב גילוח.

סמן את המיקרוקטטר במרחק 16 מילימטרים מהקצה כדי לסמן את היקף הקטטר שיש לקדם תוך-לומינרית. הטרומבואמבולים הטעונים מראש הוזרקו לעורק התרדמה הפנימי של 135 נבדקים בשש מעבדות מחקר כדי לבדוק את היתכנות מודל החסימה של העורק המוחי התיכון התרומבומבולי. הדמיית תהודה מגנטית בוצעה לאחר שלושה ימים ב-102 בעלי חיים, מה שמעיד על שיעור סיום של 75%.

אובדן בעלי חיים לפני ההדמיה היה עקבי בכל שש המעבדות. נפח הנגע הממוצע בכל האתרים היה 13% מחצי הכדור האיפסילטרלי, עם שונות מסוימת בין שש המעבדות. הפרוטוקול שלנו מחקה קרישה אנושית ותרומבוליזה, מפחית שימוש בבעלי חיים, מאחד ניתוחים ומשיג שחזוריות אמינה של רב-מרכזיים.

כתוצאה משמעותית של המחקר שלנו, יצרנו מודל TE-MCAo שניתן להרחבה וניתן לשחזור, שניתן להשתמש בו במעבדות שונות עם תוצאות עקביות ובקרת איכות מובנית. מודל זה יכול לשמש באופן עקבי הן במחקרי שבץ חד-מעבדתי והן במחקרים רב-מעבדתיים, תוך שיפור הסינון הטיפולי והאצת תרגום טיפולים מועמדים להגנה מוחית.