פרוטוקול ניתוחי לחלון גולגולתי גדול וניתן לסגירה מחדש המאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לאורך זמן ורב-מודליות של רשת מצב ברירת מחדל של העכבר

רשת מצב ברירת המחדל, או DMN, היא רשת קריטית בקנה מידה רחב, המעורבת במגוון תפקודים קוגניטיביים ובהפרעות נוירופסיכיאטריות כגון דיכאון. חקר הדינמיקה המורכבת של ה-DMN במודלים של בעלי חיים מספק תובנות יקרות ערך לגבי תפקידה הן במצבים בריאים והן במצבים פתולוגיים. עם זאת, אתגר משמעותי היה ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יציבות, ארוכות טווח ובקנה מידה גדול מנקודות עמוקות ומפוזרות מרובות, ה-DMN, בעכברים ערים ומתנהגים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניתוחי דו-שלבי חדשני שפותח במעבדתו של Eero Castren. טכניקה זו יוצרת חלון גולגולתי גדול, עמיד וניתן לסגירה מחדש, המאפשר הקלטות אורך חוזרות מיותר מ-1,000 ערוצי אלקטרודות בו-זמנית. זה מושג על ידי שילוב מיקרו-אלקטרוקורטיקוגרפיה ברמת פני השטח, מיקרו-ECoG, עם שני גשושי נוירופיקסלים, המאפשרים גישה חסרת תקדים לרשת מצב ברירת המחדל.

הסרטון הזה יספק מדריך שלב אחר שלב להליך הכירורגי החזק הזה, מהכנת בעלי חיים והשתלת לוח ראש ועד ליצירת חלון הגולגולת הכרוני, ויבטיח רכישת נתונים איכותית וארוכת טווח למחקר נוירו-מדעי הרשת. כל ההליכים שהוצגו אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בפינלנד ועומדים בהנחיה האירופית להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. שלב 1, הכנת בעלי חיים והשתלת לוחית ראש.

לביצוע הליך זה, יש להתחיל בהכנת כל החומרים והציוד הכירורגי הנדרשים. הרדימו את העכבר ב-4% איזופלוראן ושמרו על הרדמה של 1.5 עד 2.5% עם קצב זרימת חמצן של 0.5 ליטר לדקה. מגלח את הפרווה מהחלק העליון של הראש והניח את החיה על כרית חימום מבוקרת המצוידת בחיישן טמפרטורה פנימי שמכויל לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך.

מרחו משחת עיניים קרבומר למניעת ייבוש בקרנית. אבטח את העכבר במסגרת הסטריוטקטית כך שהגולגולת תישאר שטוחה ונתן משככי כאבים ותרופות אנטי-דלקתיות לפני הניתוח באמצעות הזרקות תת-עוריות, קרפרופן, בופרנורפין ודקסמתאזון. חטא את האזור המגולח בתמיסת פובידון-יוד והזריק תמיסת לידוקאין-אפינפרין כהרדמה מקומית מתחת לעור הקרקפת.

בצע חתך רוחבי קטן בקו הראש והגדל את החתך בהדרגה כדי לחשוף במלואו את חלק העליון של פני הגולגולת. נקה בזהירות את הגולגולת החשופה עם אצטון עד שכל הפריוסטאום הנראה הוסר כדי להבטיח הידבקות חזקה של השתל. השתמשו בלהב סכין עגול וקהה כדי להסיר שאריות של פריוסטאל ורקמות חיבור שלא נפתרו לחלוטין עם שטיפת האצטון.

עם המכשיר הסטריאוטקטי, יש לסמן שטח מלבני בגודל 4 מילימטרים על 7.6 מילימטרים על הגולגולת ביחס לברגמה. המלבן צריך להימשך שני מילימטרים לרוחב מהברגמה משני הצדדים, שלושה מילימטרים לצד האחורי ו-4.6 מילימטרים בזנב. לאחר מכן, סמן את שני אתרי החדרת הגשוש התוך-גולגולתי בחצי הכדור הימני.

סמן את אתר הגשוש הרוסטרלי במרחק של 1.66 מילימטרים קדמי ו-1.95 מילימטרים לרוחב מהברגמה, ואת אתר הגשוש הזנבי במרחק 2.2 מילימטרים אחורי ו-1.9 מילימטרים לרוחב מהברגמה. לאחר מכן, חרטו דפוס צלבי על כל משטחי העצם החשופים מחוץ לאזור החלון המיועד, באמצעות להב ניתוחי מספר 11, ויוצרים חריצים רדודים אך מוגדרים בעומק של כ-0.2 עד 0.4 מילימטרים ליצירת רשת אחידה של כ-1 על 1 מילימטר ריבוע. צור מכשיר דבק דק על ידי חיבור מחט סטרילית של 30G לקצה מטלית כותנה וכופף את המחט לצורת V.

זרקו דבק ציאנואקרילט לתוך סירת שקילה מפלסטיק חד-פעמית וטבלו את המאפליקטור במיכל הדבק. יש להניח דבק על כל משטח עצם חשוף וחרוט, תוך יישום לא יותר מהשקיעה אחת לכל אתר כדי שהכיסוי יהיה יסודי, אך לעולם לא מופרז. תן לדבק להתייבש במשך שבע דקות לפני שממשיכים.

להשתלת שקע ההתייחסות, בחרו את אתר הקידוח מעל מיקום המוחון השמאלי כדי להימנע מכלי דם שטחיים גלויים. קדחו את חור הפיילוט בפיצוצים של חמש עד עשר שניות באמצעות קבר פלדה עגול בקצב של 20,000 עד 25,000 כדורים לדקה עד שהחור הופך לשקוף יותר, וחושף גוון ורוד בהיר. הכנס את שקע ההתייחסות המצופה זהב לחור הפיילוט, אבטח אותו בדבק ציאנואקרילט, וחיזק את הצומת עם מלט דנטלי שניתן לרפא ב-UV.

תקן את המלט הדנטלי עם מנורת LED לטיפול בדקה אחת. לאחר מכן, מניחים כמות קטנה של מלט דנטלי שניתן לריפוי ב-UV על קצה עצם הרוסטרל החשופה, והניחו את לוח הראש מתחת לגולגולת כך שאחד הקצה מונח על פיגום המלט הדנטלי, מתייבש סביב שקע הייחוס, והקצה הנגדי מונח על טביעת המלט הרוסטרלי הטרי. תוודא שראש הכיסוי ממוקם במרכז ומאוזן.

חיזקו את המבנה על ידי מריחת מלט דנטלי סביב בסיס לוח הראש והקפת העצם החקוקה והשקע עד שנוצר מעטפת רציפה ואטומה סביב היקף חלון הגולגולת העתידי. ולבסוף, ייבשתי את המלט הדנטלי עם נורת LED של עט לריבוש למשך דקה. לאחר שהמלט התייבש לחלוטין, אפשר לעכבר להתעורר מההרדמה.

השלב הראשון הושלם כעת. אפשר לעכבר להתאושש לפחות 48 שעות לפני המעבר לשלב הבא. שלב 2, יצירת חלון קרניאלי כרוני.

השלב השני דורש את אותם כלים ותרופות כמו השלב הראשון, למעט ההרדמה המקומית. בנוסף, שלב זה דורש ממברנת PDMS סטרילית ודקיקה, נוזל מוח-שדרתי מלאכותי קר שנשמר על קרח, איטום סיליקון אלסטומר, וכיסוי מגן מותאם אישית מודפס בתלת-ממד. לפחות 48 שעות לאחר הניתוח הראשון, הרדמו מחדש את העכבר עם איזופלורן, הניחו אותו על כרית החימום במסגרת הסטריאוטקטית, ומתן את התרופות לפני הניתוח כמו בשלב הראשון למעט ההרדמה המקומית של לידוקאין-אפינפרין.

התחילו לדלל את העצם עם המקדחה הדנטלית לאורך קו המתאר המלבני המסומן בשלב 1, החל מ-25,000 כדורים לדקה כאשר מכשיר הקידוח מוחזק בזווית של 90 מעלות יחסית לפני העצם, ובצעו מעבר או שניים מעט עמוק יותר לאורך קצוות המלבן כדי ליצור חריץ חיתוך ראשוני. קדחו חריצים רדודים בעצם ובמלט דנטלי הסמוך לחלון הגולגולת בשני קואורדינטות החדרת הגלאי. חריצים אלו משמשים כנקודות ציון ויזואליות מתמשכות שנשארות גלויות לאחר הסרת הפל העצם ומשמשים למיקום מחדש של הגשושים התוך-גולגולתיים באופן שחזורי במפגשים אלקטרופיזיולוגיים הבאים.

מרחו באופן קבוע נוזל מוח-שדרתי מלאכותי קר וסטרילי לאורך כל הקידוח כדי למנוע נזק תרמי לקורטקס הבסיסי ולהפחית דימום. הפחת בהדרגה את מהירות הקידוח ל-20,000 כדורים לדקה ככל שהעצם מתדללת. המשך לקדוח לאורך היקף המלבן עד שהעצם בתוך הקו מתדלדל בכ-90%.

אל תקדח לגמרי דרך הגולגולת. עבור לוו דורה המעוקל והעדיין. הכנס את הקצה מתחת לשפת העצם הדקה בזהירות רבה, והחליק את הקרס לאורך היקף החלון, תוך ניתוק זהירות של הדש מהגולגולת ומהרקמה שמתחת.

הרימו בזהירות את פתח העצם שנותק בהצלחה עם קרס הדורה בכיוון אחורי לקדמי לכ-35 מעלות מעל פני הגולגולת. אחז בקצה המורמת עם המלקחיים והתנדנד בעדינות שמאלה וימינה עד שהפלטה משתחררת לחלוטין. פנה בעדינות את האזור החשוף מדם קריש עם שטיפות חוזרות של ACSF קר כקרח.

הניחו ממברנת PDMS סטרילית אחת ישירות מתחת לפני השטח הדוראלי לאחר שהדימום פסק. כאשר הוא בגודל נכון, הוא יכסה את החלון בדיוק וייצמד באופן פסיבי לדורה, ומחזיק אותו שטוח כנגד המוח. אטימו את הקרניוטומיה על ידי מריחת איטום סיליקון.

מלא כל חריץ בין מארז המלט הדנטלי לשוליים הפנימיים של לוח הראש, תוך הקפת והחפיפה המלאה של קצוות ממברנת ה-BDMS. הדביקו כיסוי מגן מותאם אישית מודפס בתלת-ממד על הלוח עם כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט כדי להגן על החלון בין סשני ההקלטה. העכבר מוכן כעת להחלמה ויש להעבירו לכלוב הבית שלו למגורים אישיים כדי למנוע נזק לשתל.

ניתוח מוצלח מוביל לחלון שקוף וברור מעל הקורטקס, עם כלי דם נראים לעין וסימנים מינימליים לדלקת או זיהום. בהירות זו יכולה להימשך למעלה מ-21 ימים, מה שמאפשר מחקרים ארוכי טווח לאורך זמן. אותות אלקטרופיזיולוגיים גולמיים שנרשמו דרך החלון הכרוני שמרו על איכות גבוהה לאורך ציר הזמן האורכי.

כאן, עקבות מיקרו-ECoG רחב-פס מייצגות שנדגמו מרשת רטרוספלניאלית אחורית ועקבות פוטנציאל שדה מקומי תוך-גולגולתי בו-זמנית שנדגמו מתעלה קורטיקלית שטחית מוצגות זה לצד זה ביום ההקלטה הראשון ו-21 הימים לאחר מכן. הקלטות יום 21 מציגות אמפליטודת אות דומה, תכולת ספקטרל, והיעדר ארטיפקטים של תנועה ורעש בהשוואה להקלטות יום 0 מאותו בעל חיים, מה שמאשר כי לא הנוכחות הכרונית של ממברנת ה-PDMS ושל אטם הסיליקון ולא הניקובים החוזרים של דורל לא יצרו פגיעה ניתנת לזיהוי של איכות האות של פני השטח או של הגשוש התוך-גולגולתי בשכבות קורטיקליות שטחיות שבהן צפוי להתרחש התפרקות ראשונה. האישור העיקרי של טכניקה זו הוא רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים מולטימודליים יציבים ואיכותיים לאורך זמן.

החלון הניתן לסגירה מחדש מאפשר החדרה חוזרת של גשושים כדי להקליט מאותן אוכלוסיות נוירונים לאורך שבועות. על פני תחום האלפא, מטריצות ערך נעילת פאזה שחושבות מהתעלות לאורך גלאי האלקטרודה התוך-גולגולתי בצפיפות גבוהה הזנב מראות ארכיטקטורה פונקציונלית יציבה בין קו הבסיס למפגש היום ה-21 לאחר הטיפול. זה מראה החדרה חוזרת לאותו מיקום קורטיקלי במקום מעקב פורמלי אחרי אותם נוירונים בודדים.

למרות שתרגום האינטרסציה הקטן של השוק שולל את אותה טענה יחידה, המבנה הלמינרי והאזורי הכולל של האינטראקציות בין פס האלפא נשמר, ותומך בכך שהחלון הכרוני מאפשר דגימה אורכית של אותו מעגל פונקציונלי. כדי לאמת ישירות שהחלון הכרוני תומך במיקוד למינרי שחזורי של אותם מבנים עמוקים בין סשנים, חישבו מפות צפיפות מקור זרם או CSD מערוצי ה-LFP של הגשושים. פרופילי CSD המעוררים גירוי מראים כי חתימות מקור השקיעה הלמינריות הצפויות, כולל הקורטקס הפרהלימבי ואזור הצינגולט הקדמי, נשמרות בין המפגשים.

שכבות פרופיל ההספק הלמינריות בין שני המפגשים דומות מאוד בין המפגשים, כאשר קורלציה של פירסון היא 0.81. ההבדלים שנצפו בקורטקס המוטורי המשני נובעים ככל הנראה מהבדלים בתנועה בין ההקלטות. מכיוון ששרטוט CSD נושא מידע אנטומי, הוא יכול לספק קריאה לא סופית במהלך המפגש מאילו אזורים מוחיים כל גלאי דוגם כיום, ללא תלות בצביעות רקמה לאחר המוות.

השחזוריות של מיקום מיקרו-ECoG על פני השטח בין מפגשים נמדדת באופן עצמאי מקריאת CSD התוך-גולגולתית. מפות הספק מרחביות מוגבלות בתחום המחושבות מרשת מיקרו-ECoG ביום 0 ויום 21 משולבות, ומתאם פיקסלים בין שתי המפות מחושב בנפרד עבור תת-הרשת הרוסטרלית והזנבית. קורלציות פרופיל תת-רשת נשארות גבוהות וברקודים מרחביים של שני המפגשים הציגו באופן גלוי את אותם נקודות הספק קורטיקליות הן בחצאי הרוסטרל והן בחצאי הזנב של המערך.

תור יישור סינוסואידלי הנראה דרך הרשת השקופה יחד עם חריצי העצם החרוטים בקואורדינטות החדרת הגלאי תומכים ביכולת השחזור בקנה מידה מילימטרי של מיקום מיקרו-ECoG לאורך מרווח אורך של 21 ימים. כדי לאמת את הטכניקה עוד יותר, בוצעו צביעות אימונוהיסטוכימיות ל-GFAP ו-IBA1 בפרוסות מוח לאחר המוות כארבעה שבועות לאחר ניתוח הקרניוטומיה. GFAP מתבטאים על ידי אסטרוציטים, אשר מוותרים בגליוזיס תגובתי כגון פגיעות מוח או דלקת.

לעומת זאת, IBA1 מתבטא במיקרוגליה, שהן פעילות יותר במהלך תהליכים נוירודלקתיים. קבוצת האימות כללה בעלי חיים שביצעו ניתוח דו-שלבי מלא וחלון הגולגולת נפתח מחדש שלוש פעמים ביום 0, 21 ו-22 לאחר הניתוח. עם זאת, לא בוצעו הצבת מיקרו-ECoG או הכנסת גשושים תוך-גולגולתיים בקבוצה זו.

החלון נסגר מחדש בין המפגשים כמו בהקלטה אלקטרופיזיולוגית. לכן, קבוצה זו מבודדת את התרומה הדלקתית של החלון הכרוני והחשיפה החוזרת לדורל מכל נזק רקמתי שנגרם על ידי הגשוש. לא נצפו הבדלים משמעותיים באף אחד מהסמנים בין קבוצת הביקורת ללא ניתוח לבין קבוצת הרכב שעברה ניתוח.

מיקרוגרפים מייצגים אלו אינם מראים עדות איכותית לגליוזיס תגובתי או להפעלה מיקרוגליאלית באזור שמתחת לחלון. עם זאת, נצפתה עלייה קלה בפעילות המיקרוגליאלית והאסטרוציטים בסמוך למסלול הגשושית ובחצי הכדור של הכנסת הגלאי בהתאמה, ככל הנראה כתוצאה ממהירות החדרה גבוהה מדי של הגשוש התוך-גולגולתי. ניתוח מוצלח יוצר חלון ברור ושקוף מעל הקורטקס עם דלקת מינימלית.

לאחר תקופת הטיפול הכרוני, עלולה להתרחש נפיחות מוחית מסוימת. ניתן לנהל זאת באמצעות ניטור קפדני ואם יש צורך, מתן משככי כאבים נוספים. להקלטות, פשוט הסר את הפקק והאיטום, הנח את רשתות המיקרו-ECoG וגשושי ה-Neuropixels והתחל באיסוף נתונים מהחיה הערה והמתנהגת.

לסיכום, פרוטוקול הניתוח הדו-שלבי הזה מספק שיטה אמינה ויעילה מאוד ליצירת חלון גולגולתי כרוני גדול בעכברים. היתרונות המרכזיים של ההליך הם הנזק המינימלי לדורה והחשיפה הגדולה שהוא מספק, דבר קריטי למיקום סימולטני של רשתות מיקרו-ECoG שטחיות ושל מספר גשושי נוירופיקסלים עמוקים במוח. שיטה זו מאפשרת חקירה ארוכת טווח חסרת תקדים של דינמיקה אלקטרופיזיולוגית רחבת הרשת ב-DMN ובמעגלים רחבי היקף אחרים.

הוא פותח דלת לחקירות עמוקות יותר על יסודות עצביים של התנהגויות מורכבות והפתופיזיולוגיה של הפרעות מוח, ובסופו של דבר מסייע בפיתוח טיפולים חדשניים.