Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Materiali
Buffer
<ol><li>Tampone di lavaggio: 1 X soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio</li>
	<li>Tampone di fissazione: 1% di paraformaldeide in PBS</li>
	<li>Tampone di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS</li>
	<li>Tampone bloccante: 1% di albumina sierica bovina in PBS</li>
	<li>Mezzo di crescita cellulare: DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), penicillina / streptomicina e L-glutammina</li>
</ol>Attrezzatura
<ol start="6"><li>Cappa a flusso laminare</li>
	<li>Incubatore umidificato (37°C, 5% CO2)</li>
	<li>Microscopio a scansione laser confocale; qui, Nikon Eclipse Ti laser</li>
</ol>Materiali e reagenti
<ol start="9"><li>Vetrini per colture cellulari a camera</li>
	<li>Supporti di montaggio anti-dissolvenza con DAPI (per la colorazione dei nuclei)</li>
	<li>Vetro di copertura del microscopio</li>
	<li>Salviette delicate</li>
	<li>Pipettors e punte</li>
</ol>Reagenti specifici per il saggio
<ol start="14"><li>Cellule aderenti (cellule primarie o linee cellulari); qui sono stati utilizzati fibroblasti di topo trasfettato con CD1d (LCD1).</li>
	<li>Anticorpi primari per rilevare bersagli cellulari; qui sono stati utilizzati ratto anti-mouse CD107a (LAMP-1) e mouse anti-mouse CD1d.</li>
	<li>Anticorpi secondari coniugati con fluoroforo specifici per gli isotipi degli anticorpi primari; qui sono state utilizzate IgG anti-ratto coniugate ad Alexafluor 488 e IgG anti-mouse coniugate ad Alexafluor 647.</li>
</ol>2. Protocollo
Preparazione per la colorazione degli anticorpi
Cellule di semina
<ol><li>Sospendare le cellule di interesse per i mezzi di crescita.</li>
	<li>Quindi, seminare 500 μL della sospensione cellulare / per pozzo nei pozzeli di una slitta a 4 pozzetta. (Qui, le cellule LCD1 sono state seminate a 2,5x105 celle / camera in 500 μL di mezzi di crescita. La densità di semina può variare tra le linee cellulari).</li>
	<li>Incubare la camera scivolare durante la notte in un incubatore a CO2 al 5% a 37 ° C, per consentire alle cellule di aderire al vetro.</li>
	<li>Il giorno successivo, aspirare il mezzo da ciascun pozzo e quindi lavare le cellule 1X con PBS da 500 μL.</li>
</ol>Fissazione
<ol start="5"><li>Per fissare le cellule, aggiungere 500 μL soluzione di paraformaldeide all'1% in ciascun pozzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un contenitore di rifiuti liquidi pericolosi appropriato.</li>
	<li>Quindi, lavare le cellule 3 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali residui del fissativo.</li>
</ol>Permeabilizzazione
<ol start="8"><li>Permeabilizzare le cellule incubando con tampone/pozzo di permeabilizzazione da 500 μL per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quindi, lavare brevemente le cellule 3 volte con 500 μL di PBS.</li>
</ol>Inceppamento
<ol start="10"><li>Incubare le cellule in ciascun pozzo con un tampone bloccante da 500 μL per 1 ora a 4°C, per bloccare il legame anticorpale non specifico.</li>
</ol>Incubazione di anticorpi primari
<ol start="11"><li>Aspirare il tampone di blocco dalle camere di scorrimento.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 500 μL di soluzione anticorpale primaria diluita alle cellule. (Qui, l'anti-CD107a (LAMP-1) è stato diluito 1:500 e l'anti-CD1d è stato usato non diluito (l'anticorpo monoclonale 1H6 è stato gentilmente fornito dal Dr. Randy Brutkiewicz)).</li>
	<li>Incubare i vetrini durante la notte a 4°C.</li>
</ol>Nota: se si esegue il sondaggio per più di un bersaglio, assicurarsi che gli anticorpi primari siano isotipi diversi. Le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell'uso.
Incubazione di anticorpi secondari
<ol start="14"><li>Aspirare la soluzione anticorpale primaria dai pozzi.</li>
	<li>Lavare le camere del pozzo 4 volte con 500 μL PBS.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 500 μL della soluzione anticorpale secondaria diluita a ciascun pozzo. (Qui, entrambi gli anticorpi secondari - anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-ratto IgG Alexafluor 488 sono stati diluiti 1:2000 nel buffer di blocco).</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 1 ora al buio.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione anticorpale secondaria.</li>
	<li>Lavare le camere 4 volte con PBS da 500 μL per rimuovere eventuali anticorpi secondari non legati.</li>
</ol>Nota: le concentrazioni di anticorpi raccomandate variano tra i produttori e devono essere titolate prima dell'uso. Se si sonda più di un bersaglio, gli anticorpi secondari devono essere coniugati a diversi fluorofori con spettri di eccitazione/emissione unici. Tieni anche presente l'eccitazione / emissione della controstipitazione nucleare (cioè DAPI) durante la selezione dei fluorofori. La selezione del fluoroforo può essere influenzata dalla configurazione laser del microscopio confocale utilizzato. La configurazione laser della macchina determinerà quali fluorofori sono adatti per l'esperimento.
3. Coperture di montaggio
<ol><li>Innanzitutto, rimuovere con attenzione le camere dalla diapositiva.</li>
	<li>Quindi, tenere la diapositiva ad angolo su una delicata pulizia e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle.</li>
	<li>Aggiungere 1 goccia di mezzo di montaggio antifiade, contenente la macchia nucleare DAPI, su ogni sezione di celle.</li>
	<li>Quindi, posizionare un coverslip di 20 mm x 60 mm sulla diapositiva tenendolo sui bordi con la punta delle dita. (Evitare la formazione di bolle sulle cellule, in quanto interferiscono con l'imaging).</li>
	<li>Pulire qualsiasi mezzo di montaggio aggiuntivo sui lati con una delicata pulizia e conservare le diapositive al buio a temperatura ambiente fino a una settimana.</li>
</ol>4. Imaging confocale
Campioni di immagini su un microscopio a scansione laser confocale. Per i dati mostrati nella Figura 2, la Nikon Eclipse Ti A1R è stata utilizzata con il software NIS Elements Advanced Research. La sezione seguente descrive in dettaglio la procedura per l'acquisizione di immagini utilizzando il software di cui sopra.
<ol><li>Per iniziare a immaginare le cellule, apri il 'software NIS Elements Advanced Research' facendo clic sull' ' icona del softwareNIS'.</li>
	<li>Successivamente, nella finestra di controllo fare clic sulla scheda'TiPad'e scegliere l'obiettivo desiderato per l'imaging. (Qui è stato utilizzato il primo obiettivo 40x).</li>
	<li>Caricare la diapositiva con le celle sullo stage e centrarla sotto l'obiettivo.</li>
	<li>Ora, nella scheda'A1plus Compact GUI',impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell'ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale e selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale.</li>
	<li>Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico.</li>
	<li>Successivamente, nella finestra'A1plus Compact GUI',fare clic su'Ch. Series'per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati spareranno sul campione contemporaneamente o in sequenza. (Qui sono state scelte le passate sequenziali, a partire dal canale 1, seguito dal canale 2, quindi dal canale 4).</li>
	<li>Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull'icona "Punta freccia" in alto. A questo punto mentre l'immagine è in diretta, sotto la finestra'A1plus Compact GUI',clicca sulla scala scorrevole e modifica la dimensione del foro stenopeico per assicurarti di limitare la luce fuori fuoco. (Qui è stata utilizzata l'impostazione più bassa disponibile (0,5).</li>
	<li>Successivamente, regolare le impostazioni di 'alta tensione' e 'offset' sotto ogni laser a livelli appropriati, utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione con colorazione positiva, iniziare con l'imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni laser producano rapporti segnale/rumore ottimali. Attenzione: un'elevata intensità laser per periodi prolungati può causare fotosciviazione.
</li>
	<li>Dopo aver impostato i valori HV e offset ottimali per ciascun laser, fare clic sullascheda 'ND Acquisition'e quindi selezionare l'icona'Z'per impostare i parametri per la serie z. Successivamente, mentre acquisisci un'immagine dal vivo del campione, imposta prima il fondo trovando la parte inferiore dell'immagine e facendo clic sul pulsante 'in basso 'in basso',quindi trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante'in alto'. Impostare la dimensione del passo digitando specificamente la dimensione del passo preferita in μm per ogni passaggio o specificando quanti passaggi totali sono necessari.</li>
	<li>Una volta impostati i parametri della serie z, selezionare la dimensione desiderata/risoluzione pixel dell'immagine. Per fare ciò, fai clic sulla finestra'A1plus Compact GUI'e sotto l'icona'size'seleziona la risoluzione desiderata. Per ridurre il rumore dell'immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo 'ø' per fare la media del numero selezionato di immagini.</li>
	<li>Ora, fai clic sulla scheda"Esegui ora"nelmenu "Acquisizione ND"per avviare l'imaging del campione.</li>
	<li>Al termine dell'imaging, salvare l'immagine facendo clic su'File',quindi su'Salva con nome',che esporterà il file immagine con estensione'.nd2'. Infine, ripetere il processo per ciascuno degli altri campioni.</li>
</ol>

La colorazione fluorescente confocale è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità di campioni preparati in modo simile alla microscopia a fluorescenza convenzionale. In breve, i campioni vengono fissati, permeabilizzati, quindi bloccati. Gli anticorpi primari contro una proteina o proteine di interesse sono autorizzati a legarsi, quindi gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo vengono utilizzati per visualizzare la colorazione. La microscopia a fluorescenza confocale ha ...

microscopia a fluorescenza confocale: una tecnica per determinare la localizzazione delle proteine nei fibroblasti di topo

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Fonte: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 1 Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, University of Maryland School of Medicine e Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimora, Maryland 21201 2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimora, Maryland 21201
La microscopia a fluorescenza confocale è una tecnica di imaging che consente una maggiore risoluzione ottica rispetto alla microscopia a epifluorescenza convenzionale "a campo largo". I microscopi confocali sono in grado di ottenere una migliore risoluzione ottica x-y attraverso la "scansione laser", in genere un insieme di specchi controllati in tensione (galvanometro o specchi "galvo") che dirigono l'illuminazione laser a ciascun pixel del campione alla volta. Ancora più importante, i microscopi confocali raggiungono una risoluzione z-assiale superiore utilizzando un foro stenopeico per rimuovere la luce fuori fuoco proveniente da posizioni che non si trovano nel piano z in fase di scansione, consentendo così al rilevatore di raccogliere dati da un piano z specificato. A causa dell'elevata risoluzione z ottenibile in microscopia confocale, è possibile raccogliere immagini da una serie di piani z (chiamati anche z-stack) e costruire un'immagine 3D tramite software.
Prima di discutere il meccanismo di un microscopio confocale, è importante considerare come un campione interagisce con la luce. La luce è composta da fotoni, pacchetti di energia elettromagnetica. Un fotone che impaa su un campione biologico può interagire con le molecole che compongono il campione in uno dei quattro modi: 1) il fotone non interagisce e passa attraverso il campione; 2) il fotone viene riflesso/disperso; 3) il fotone viene assorbito da una molecola e l'energia assorbita viene rilasciata come calore attraverso processi noti collettivamente come decadimento non radiativo; e 4) il fotone viene assorbito e l'energia viene quindi rapidamente riemessa come fotone secondario attraverso il processo noto come fluorescenza. Una molecola la cui struttura consente l'emissione di fluorescenza è chiamata fluoroforo. La maggior parte dei campioni biologici contiene fluorofori endogeni trascurabili; pertanto i fluorofori esogeni devono essere utilizzati per evidenziare le caratteristiche di interesse nel campione. Durante la microscopia a fluorescenza, il campione viene illuminato con luce della lunghezza d'onda appropriata per l'assorbimento da parte del fluoroforo. Dopo aver assorbito un fotone, si dice che un fluoroforo sia "eccitato" e il processo di assorbimento è indicato come "eccitazione". Quando un fluoroforo cede energia sotto forma di fotone, il processo è noto come "emissione" e il fotone emesso è chiamato fluorescenza.
Il fascio di luce utilizzato per eccitare un fluoroforo è focalizzato dalla lente obiettiva di un microscopio e converge in un "punto focale" dove è focalizzato al massimo. Oltre il punto focale la luce diverge di nuovo. I fasci in entrata e in uscita possono essere visualizzati come una coppia di coni che toccano il punto focale (vedere figura 1, pannello di sinistra). Il fenomeno della diffrazione impone un limite alla misura in cui un fascio di luce può essere focalizzato - il raggio in realtà si concentra su un punto di dimensioni finite. Due fattori determinano la dimensione del punto focale: 1) la lunghezza d'onda della luce e 2) la capacità di raccolta della luce della lente dell'obiettivo, che è caratterizzata dalla sua apertura numerica (NA). Lo "spot" focale si estende non solo nel piano x-y, ma anche nella direzione z, ed è in realtà un volume focale. Le dimensioni di questo volume focale definiscono la massima risoluzione ottenibile con l'imaging ottico. Sebbene il numero di fotoni sia maggiore all'interno del volume focale, i percorsi di luce conica sopra e sotto la messa a fuoco contengono anche una minore densità di fotoni. Qualsiasi fluoroforo nel percorso della luce può quindi essere eccitato. Nella microscopia a epifluorescenza convenzionale (a campo largo), l'emissione di fluorofori sopra e sotto il piano focale contribuisce alla fluorescenza fuori fuoco (uno "sfondo nebuloso"), che riduce la risoluzione e il contrasto dell'immagine, come dimostrato nella Figura 1, con il cubo rosso che rappresenta l'emissione di fluoroforo sopra il piano focale (stella rossa) che si traduce in fluorescenza fuori fuoco (in alto a destra). Questo problema è migliorata nella microscopia confocale, a causa dell'utilizzo di un foro stenopeico. (Figura 2, in basso a destra). Come illustrato nella Figura 3, il foro stenopeico consente alle emissioni provenienti dal punto focale di raggiungere il rilevatore (a sinistra), impedendo al contempo alla fluorescenza fuori fuoco (a destra) di raggiungere il rilevatore, migliorando così sia la risoluzione che il contrasto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> Figura 1. Risoluzione ottica dell'epifluorescenza rispetto alla microscopia confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il fascio di luce utilizzato per eccitare un fluoroforo è focalizzato dalla lente obiettiva di un microscopio e converge a un volume focale e poi diverge (a sinistra). La stella rossa rappresenta il piano focale di un campione che viene ripreso mentre il quadrato rosso rappresenta l'emissione di fluorofori sopra il piano focale. Quando si cattura un'immagine di questo campione utilizzando un microscopio epifluorescente, l'emissione dal quadrato rosso sfocato sarà visibile e contribuirà a uno "sfondo nebuloso" (in alto a destra). I microscopi confocali hanno un foro stenopeico che impedisce il rilevamento della luce emessa al di fuori del piano focale, eliminando lo "sfondo nebuloso" (in basso a destra).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> Figura 2. Effetto stenopeico in microscopia confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Sebbene la massima intensità della luce di eccitazione sia nel punto focale della lente (sinistra, ovale rosso), altre parti del campione non nel punto focale (destra, stella rossa) riceveranno luce e fluorescenza. Per evitare che la luce emessa da queste regioni fuori fuoco raggiunga il rilevatore, uno schermo con un foro stenopeico è presente davanti al rilevatore. Solo la luce a fuoco (a sinistra) emessa dal piano focale è in grado di viaggiare attraverso il foro stenopeico e raggiungere il rilevatore. La luce fuori fuoco (a destra) è bloccata con il foro stenopeico e non riesce a raggiungere il rilevatore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> Figura 3. Componenti principali di un microscopio a scansione laser confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per semplicità, la descrizione meccanicistica di un microscopio confocale sarà limitata a quella del Nikon Eclipse Ti A1R. Sebbene ci possano essere piccole differenze tecniche tra i diversi microscopi confocali, l'A1R funge bene da buon modello per descrivere la funzione del microscopio confocale. Il fascio di luce di eccitazione, prodotto da una serie di laser a diodi, viene riflesso dallo specchio dicroico primario nell'obiettivo, che focalizza la luce sul campione che viene ripreso. Lo specchio dicroico primario riflette selettivamente la luce di eccitazione mentre consente alla luce ad altre lunghezze d'onda di passare. La luce incontra quindi gli specchi di scansione che spazzano il fascio di luce attraverso il campione in modo x-y, illuminando un singolo(x,y)pixel alla volta. La fluorescenza emessa dai fluorofori al pixel illuminato viene raccolta dalla lente dell'obiettivo e passa attraverso lo specchio dicroico primario per raggiungere una serie di tubi fotomoltiplicatori (PMT). Gli specchi dicroici secondari dirigono la luce di emissione verso il PMT appropriato. La luce di eccitazione diffusa dal campione nell'obiettivo viene riflessa dallo specchio dicroico primario verso il campione, impedendo così di entrare nel percorso luminoso di rilevamento e raggiungere i PMT (vedere Figura 3). Ciò consente di quantificare la fluorescenza relativamente debole senza contaminazione da parte della luce diffusa dal fascio di luce di eccitazione, che è tipicamente ordini di grandezza più intenso della fluorescenza. Poiché il foro stenopeico blocca la luce dall'esterno del volume focale, la luce che arriva al rilevatore proviene da un piano zstretto e selezionato. Pertanto, le immagini possono essere raccolte da una serie di piani zadiacenti; questa serie di immagini è spesso indicata come "z-stack". Utilizzando il software appropriato, è possibile elaborare uno z-stack per generare un'immagine 3D del campione. Un particolare vantaggio della microscopia confocale è la capacità di distinguere la localizzazione subcellulare della colorazione. Ad esempio, la differenziazione tra la colorazione di membrana dalla colorazione intracellulare, che è molto impegnativa con la microscopia a epifluorescenza convenzionale (1, 2, 3).
La preparazione del campione è un aspetto importante dell'imaging confocale. Un punto di forza delle tecniche di microscopia ottica è la flessibilità di immaginare cellule vive o fisse. Quando si tenta di produrre immagini 3D, a causa del numero di immagini che devono essere acquisite per uno z-stack, della difficoltà di mantenere la salute delle cellule e del movimento delle cellule vive e dei loro organelli, l'uso di cellule fisse è tipico. La procedura per fissare e colorare le cellule per la fluorescenza confocale è simile a quella convenzionalmente utilizzata nell'immunofluorescenza. Dopo la coltura in vetrini da camera o su coverslip, le cellule vengono fissate utilizzando la paraformaldeide per preservare la morfologia cellulare. Il legame anticorpale non specifico viene bloccato utilizzando albumina sierica bovina, latte o siero normale. Al fine di mantenere la specificità degli anticorpi secondari, la soluzione utilizzata non deve provenire dalla stessa specie in cui sono stati generati gli anticorpi primari. Le cellule vengono incubate con anticorpi primari che legano l'antigene di interesse. Quando si etichettano diversi bersagli cellulari, gli anticorpi primari devono essere derivati ciascuno da una specie diversa. Gli anticorpi che etichettano un antigene sono quindi legati da anticorpi secondari coniugati con fluoroforo. Gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo devono essere selezionati in modo che siano compatibili con le lunghezze d'onda dell'eccitazione laser disponibili nel microscopio confocale. Quando si visualizzano più antigeni, gli spettri di eccitazione/emissione dei fluorofori dovrebbero differire abbastanza da far sì che i loro segnali possano essere discriminati mediante analisi microscopiche. Il campione macchiato viene quindi montato su una diapositiva per l'imaging. Un mezzo di montaggio viene utilizzato per prevenire il fotosciviazione e la disidratazione del campione. Se lo si desidera, è possibile utilizzare un mezzo di montaggio contenente una controstena nucleare (ad esempio DAPI o Hoechst) (4).
Nel seguente protocollo, i fibroblasti di topo trasfettato per esprimere CD1d (LCD1) sono stati colorati con anticorpi che riconoscono CD1d e CD107a (LAMP-1). CD1d è un importante recettore simile al complesso di istocompatibilità 1 (MHC 1) presente sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene che presenta antigeni lipidici. LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein-1) è una proteina transmembrana presente principalmente nelle membrane liposomiali. Per una corretta presentazione dell'antigene, CD1d viene trafficato attraverso il compartimento liposomiale a basso pH, quindi LAMP-1 viene utilizzato come marcatore del compartimento liposomiale per questo protocollo. Sondando le cellule LCD1 con anti-CD1d e anti-LAMP-1 che sono state prodotte in diverse specie, gli anticorpi secondari con fluorofori unici possono essere utilizzati per determinare la localizzazione di ciascuna proteina nella cellula e se CD1d è presente nei compartimenti liposomiali positivi LAMP-1.

In questo esperimento, i fibroblasti di topo che esprimono il gene della glicoproteina di superficie CD1d sono stati fissati, immunosti e ripresi su un microscopio confocale. Un'immagine rappresentativa ottenuta utilizzando il protocollo di cui sopra è mostrata nella Figura 4. Nel pannello superiore di A, vengono presentate immagini a canale singolo che mostrano il modello di colorazione di ogni singolo target. Queste immagini comprendono una singola sezione (slice) dello z-stack acquisit...

Microscopia a fluorescenza confocale: una tecnica per determinare la localizzazione delle proteine nei fibroblasti di topo

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

La microscopia a fluorescenza confocale è una tecnica di imaging specializzata per la localizzazione di una proteina o di un antigene di interesse in un campione di cellula o tessuto mediante l'etichettatura dell'antigene con un colorante fluorescente coniugato con anticorpi e il rilevamento del segnale fluorescente. Offre una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla microscopia a fluorescenza ad ampio campo, con l'aiuto di due fori stenopeici posti sui piani focali della lente dell'obiettivo, che gli conferiscono il nome confocale. Consente agli utenti di visualizzare la colorazione a livello subcellulare, come la differenziazione tra la colorazione della membrana superficiale e la colorazione intracellulare. Un microscopio confocale segue un principio di base simile a quello di un classico microscopio a fluorescenza. Il fascio proveniente da una sorgente luminosa, solitamente un laser per confocale, viene riflesso da uno specchio dicroico e focalizzato da una lente dell'obiettivo sul campione. Questa luce eccita i fluorofori per emettere una lunghezza d'onda diversa, che viaggia indietro attraverso la lente dell'obiettivo e lo specchio dicroico fino a una fotocamera o a un oculare. La maggiore risoluzione di un microscopio confocale è dovuta principalmente alla presenza di due fori stenopeici, che sono fori molto piccoli attraverso i quali la luce può passare sui percorsi della luce di eccitazione ed emissione. I fori stenopeici sono posizionati strategicamente sul piano focale della lente dell'obiettivo. Ora, passiamo a uno schema della vista laterale della disposizione del microscopio per rivedere il percorso della luce. Dopo essere passato attraverso il foro stenopeico di eccitazione, il raggio di luce di eccitazione ha l'effetto di provenire da un punto focale, il che consente alla lente dell'obiettivo di focalizzare la luce anche su un punto del campione. Il fascio di emissione da questo punto focale converge in corrispondenza del foro stenopeico di emissione, che ne consente il passaggio. Ora, durante l'eccitazione, anche i fluorofori all'interno del percorso della luce, sopra e sotto il punto focale, sono leggermente eccitati. Mentre la luce di emissione proveniente dal punto focale passa attraverso il foro stenopeico, le emissioni provenienti dai punti fuori fuoco convergono prima o dopo il foro stenopeico di emissione e vengono quindi bloccate, con conseguente riduzione della fluorescenza di fondo. Il ciclo di eccitazione-emissione-rilevamento deve essere ripetuto per ogni punto di imaging nella regione di interesse, il che può essere fatto in diversi modi. Ad esempio, la scansione laser confocale utilizza specchi di scansione galvanometrici, che deviano la luce di eccitazione a diverse angolazioni. Quindi, spazzando il raggio di luce attraverso il campione nel piano XY. Il confocale a disco rotante utilizza un disco con una serie di fori stenopeici, che ruota per spostare la disposizione dei fori di spillo. Ciò consente agli utenti di illuminare ogni volta più piccoli punti di imaging nel campione, coprendo gradualmente l'intera area man mano che il disco ruota. Come risultato dei fori stenopeici, l'immagine XY sul rivelatore rappresenta un piano Z stretto. Pertanto, le immagini possono essere raccolte da una serie di piani Z consecutivi, spesso indicati come stack Z. Da queste immagini, un software appropriato può generare una rappresentazione 3D del modello del segnale di fluorescenza nel campione. In questo protocollo, si osserverà l'immunocolorazione dei fibroblasti di topo, seguita dall'imaging su un microscopio confocale per visualizzare in modo differenziale una proteina della superficie cellulare e una proteina lisosomiale. Per iniziare, utilizzando tecniche sterili, risospendere le cellule di interesse in 500 microlitri di terreno di crescita per pozzetto, quindi seminarle nei pozzetti di un vetrino a camera a quattro pozzetti. Qui, stiamo usando fibroblasti di topo che sono stati trasfettati per esprimere la molecola presentante l'antigene, CD1d. Per consentire alle cellule di aderire al vetro, posizionare il vetrino della camera in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius e incubare durante la notte. Al mattino, aspirare il terreno da ogni pozzetto, quindi lavare le cellule una volta con 500 microlitri di PBS per alcuni secondi. Per fissare le cellule, aggiungere 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide all'1% in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, raccogliere la paraformaldeide in un apposito contenitore per rifiuti liquidi pericolosi, quindi rimuovere eventuali residui del fissativo lavando le cellule tre volte con PBS per alcuni secondi. Per consentire la penetrazione degli anticorpi nelle cellule, aggiungere 500 microlitri di tampone di permeabilizzazione a ciascun pozzetto e incubare sul banco per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione, lavare brevemente le cellule tre volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius per evitare il legame di anticorpi non specifici. Preparare gli anticorpi primari, anti-CD1d e anti-LAMP-1, a concentrazioni di lavoro appropriate. Quindi, aspirare il tampone dai pozzetti e coprire le cellule in ciascun pozzetto con 500 microlitri di soluzione di anticorpi primari diluiti, quindi incubare il vetrino su una superficie piana durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, diluire gli anticorpi secondari, in questo caso un anticorpo anti-topo e anti-ratto con etichette fluorescenti distinte, in tampone bloccante a concentrazioni di lavoro appropriate. Successivamente, aspirare la soluzione di anticorpi primari dai pozzetti e quindi lavare le cellule quattro volte con 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione di anticorpi secondari diluiti a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per un'ora al buio. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare i pozzetti quattro volte con 500 microlitri di PBS per rimuovere qualsiasi anticorpo secondario non legato. Per montare i campioni dopo il lavaggio finale, staccare con cautela e rimuovere le camere dal vetrino. Per rimuovere il PBS residuo, tenere il vetrino inclinato sopra una salvietta delicata e rimuovere il fluido dai bordi senza toccare le celle. Una volta rimosso il PBS in eccesso, aggiungere una goccia di terreno di montaggio antifade, contenente il colorante nucleare DAPI, su ciascuna sezione di cellule. Quindi, prendi un vetrino coprioggetti di 20 x 60 millimetri e, usando solo la punta delle dita, inizia ad abbassare lentamente il vetrino coprioggetti su entrambi i bordi, facendo attenzione a evitare la formazione di bolle sulle cellule. Rimuovi qualsiasi supporto di montaggio extra sulle diapositive con una salvietta delicata e conserva le diapositive al buio a temperatura ambiente per un massimo di una settimana. Per iniziare l'imaging delle cellule, fare clic sull'icona del software NIS sul desktop. Una volta nella finestra di controllo, fai clic sulla scheda TiPad in alto e scegli l'obiettivo desiderato per l'imaging. Quindi, caricare la diapositiva con le celle sul tavolino e centrarla sotto l'obiettivo. Successivamente, nella scheda GUI di A1plus Compact accanto alla scheda TiPad, impostare i laser appropriati per i fluorofori utilizzati. Fare clic sul simbolo dell'ingranaggio per aprire il menu delle impostazioni di tintura e spettrale. Una volta aperto il menu delle impostazioni del colorante e dello spettro, selezionare i canali necessari e impostare il laser per ciascun canale. Quindi, selezionare le emissioni appropriate nel menu a discesa sotto il primo specchio dicroico. Successivamente, nella finestra GUI di A1plus Compact, fare clic su Ch.Series per impostare la serie di canali di linea, che imposta se i laser utilizzati spareranno sul campione contemporaneamente o in sequenza. Successivamente, avvia la scansione facendo clic sull'icona della punta della freccia in alto. A questo punto, mentre l'imaging è in tempo reale, nella finestra GUI di A1plus Compact, fare clic sulla scala di scorrimento e modificare le dimensioni del foro stenopeico per limitare la luce sfocata. Quindi, regolare le impostazioni di alta tensione e offset sotto ciascun laser ai livelli appropriati utilizzando le scale scorrevoli per consentire il rilevamento della colorazione specifica limitando al contempo qualsiasi potenziale colorazione di fondo. Se è disponibile un campione di colorazione positivo, iniziare con l'imaging di questo campione per ciascun canale per assicurarsi che le impostazioni del laser producano rapporti segnale/rumore ottimali. Dopo aver impostato i valori ottimali di HV e offset per ciascun laser, fare clic sulla scheda Acquisizione ND, quindi selezionare l'icona Z per impostare i parametri per la serie z. Successivamente, durante l'acquisizione di un'immagine dal vivo del campione, impostare prima la parte inferiore trovando la parte inferiore dell'immagine e facendo clic sul pulsante inferiore. Quindi, trova la posizione superiore del campione e fai clic sul pulsante in alto. Imposta la dimensione del passo digitando in modo specifico la dimensione del passo preferita in micron per ogni passo o specificando il numero totale di passi necessari. Per selezionare la dimensione/risoluzione in pixel desiderata dell'immagine, fare clic sulla finestra GUI di Aiplus Compact e, sotto l'icona delle dimensioni, selezionare la risoluzione desiderata. Per ridurre il rumore dell'immagine, è possibile selezionare il menu a discesa accanto al simbolo theta per calcolare la media del numero di immagini selezionato. Successivamente, fare clic sulla scheda Esegui ora nel menu Acquisizione ND per avviare l'imaging del campione. Al termine dell'imaging, salvare l'immagine facendo clic su file, quindi su Salva con nome, che esporterà il file immagine con l'estensione dot-nd2. Infine, ripeti il processo per ciascuno degli altri campioni. In questo esperimento, i fibroblasti di topo che esprimono il gene della glicoproteina di superficie CD1d sono stati fissati, immunocolorati e sottoposti a imaging su un microscopio confocale. Questa immagine mostra una singola sezione di una pila Z con un ingrandimento di 40X, dove CD1d è colorato in rosso. Il campione è stato rivestito con LAMP-1, un marcatore lisosomiale, in verde. La colorazione nucleare DAPI è stata utilizzata per mostrare i nuclei delle cellule. In un'immagine composita in cui i tre diversi canali sono uniti, l'aspetto del giallo deriva dalla sovrapposizione dei canali rosso e verde e indica un'area in cui CD1d e LAMP-1 sono co-localizzati nei lisosomi. Le aree in cui è presente un solo colore indicano la presenza di CD1d o LAMP-1 senza co-localizzazione. Questa immagine mostra un rendering 3D delle celle costruite a partire dalle immagini catturate nello z-stack e questo metodo ha permesso la costruzione di una vista laterale di questo gruppo di celle. L'immagine seguente mostra una fetta dello z-stack con un ingrandimento di 100X, dimostrando i modelli di espressione di queste due proteine in modo più dettagliato. La casella con contorno rosa sul lato destro dell'immagine mostra la sezione trasversale della coordinata x designata dalla linea rosa nell'immagine, che rappresenta la vista laterale in corrispondenza della linea rosa. Analogamente, il riquadro con contorno blu nella parte inferiore dell'immagine mostra la sezione trasversale della coordinata y designata dalla linea blu nell'immagine, che rappresenta la vista frontale in corrispondenza della linea blu. Il rendering 3D dell'immagine z-stack consente agli utenti di visualizzare l'immagine in 3D, visualizzando tutti i piani x, y e z. Questo può essere utilizzato per studiare la co-localizzazione delle diverse colorazioni in diverse regioni all'interno della cellula.

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confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

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Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Questa collezione include molte tecniche di base dei laboratori di immunologia, tra cui il labeling e il cell sorting delle cellule immunitarie. Mostra anche i metodi di propagazione per cellule immunitarie e anticorpi, così come i saggi più comuni per l'attività immunitaria tra cui l'ELISA. Infine, illustra la colorazione e l'imaging di campioni di tessuti e cellule immunitarie.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

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