Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Panoramica della procedura
Il tipico test 51Cr-release per misurare la morte cellulare prevede i seguenti passaggi:
<ol><li>Innanzitutto, le cellule bersaglio sono etichettate con Na2[51Cr]O4. Questo li distingue dalle cellule emotrici nel test.</li>
	<li>Mentre le cellule bersaglio vengono etichettate, le cellule emotrici vengono raccolte e, utilizzando la tecnica di diluizione seriale, viene generata una titolazione decrescente delle cellule emotrici in una piastra di saggio a fondo rotondo da 96 pozzetti.</li>
	<li>Alla fine dell'etichettatura della cellula bersaglio, le cellule vengono prima lavate e quindi un numero fisso di cellule viene aggiunto alla piastra di dosaggio che contiene già una serie di diluizioni di cellule emotrici.</li>
	<li>Successivamente, la miscela cellulare bersaglio-effettore viene incubata per un periodo di tempo definito per consentire una sufficiente interazione cellulare con le cellule bersaglio, per mediare la lisi cellulare.</li>
	<li>Infine, i supernatanti di coltura vengono raccolti e raccolti in tubi. La quantità di 51Cr viene quantificata utilizzando un contatore gamma.</li>
	<li>Alla fine, i dati vengono raccolti e utilizzati per calcolare la "percentuale specifica di lisi cellulare" delle cellule bersaglio.</li>
</ol>1. Etichettatura delle cellule target con 51Cr
<ol><li>Per iniziare, preparare le cellule bersaglio, (qui- linea cellulare di melanoma umano WM793), in una sospensione a singola cellula.</li>
	<li>Per fare ciò, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura del tessuto.</li>
	<li>Quindi, lavare le cellule con 5 ml di 1X PBS.</li>
	<li>Tripsinizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina alla piastra per ~ 2 min.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente il matraccio per allentare le celle dalla superficie del pallone.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di supporti RPMI al pallone e pipettare il supporto su e giù per staccare le celle.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 1200 giri/min. Decantare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di media al pellet e pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le celle in sospensione.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Trasferire 1x106 celle in un nuovo tubo conico da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1200 giri/min e decantare il surnatante.</li>
	<li>Vortice brevemente il tubo per risusciere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato indietro.</li>
	<li>Aggiungere 100 μCi di 51Cr direttamente alla sospensione della cella target WM793. Nota: Ci dovrebbe essere uno spazio di laboratorio dedicato allestito per la particolare radioattività. Inoltre, ci dovrebbe essere un'ampia schermatura al piombo per la conservazione e l'uso sicuri del 51Cr durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con 51Cr. È inoltre necessario un contatore Geiger dotato di una sonda per pancake, per sorvegliare lo spazio per possibili contaminazioni.
</li>
	<li>Aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il tubo è ora radioattivo.</li>
	<li>Posizionare il tubo in un incubatore a 37°C con uno scudo di piombo e incubare per 1 ora. Far scorrere il tubo ogni 15-20 minuti per aumentare l'assorbimento del cromo da parte delle cellule bersaglio.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule bersaglio con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali 51Cr in eccesso.</li>
	<li>Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min. Decantare FBS radioattivo lavare in un contenitore di rifiuti appropriato.</li>
	<li>Risuspenare il pellet e lavare una seconda volta con FBS. Controllare la radioattività incorporata nel pellet utilizzando un contatore Geiger.</li>
	<li>Ripresa del pellet in 10 mL di terreno completo, ottenendo una concentrazione cellulare di 105 celle/mL. Nota: La fase di conteggio delle celle dopo l'etichettatura 51Cr viene omessa qui in gran parte per motivi di sicurezza. Si può presumere che la concentrazione cellulare WM793 sia la stessa che era prima dell'etichettatura 51Cr.
</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule emotrici
<ol><li>È possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici, come le cellule T umane o di topo e le cellule NK. In questo esempio, sono stati utilizzati PBMC, isolati dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard (fino a una concentrazione di 5x106).</li>
	<li>Per iniziare, aggiungere 100 μL di terreno di coltura tissutale a ciascun pozzetti di una delle file (qui riga A, vedi Tabella 1) di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Qui, non vengono aggiunte cellule emotrici e serviranno come "vuoto" per determinare il "rilascio minimo / spontaneo di 51Cr" dalle cellule bersaglio.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> Tabella 1: 51Layout del saggio di rilascio Cr: riga A- Cellule bersaglio (104 celle / 100 μL) incubate solo con supporti (genera "vuoto" per determinare il "rilascio minimo/spontaneo di 51Cr"). Righe da B a C- pozzi contenenti diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E:T), che vanno da 50:1 a 1,5:1. Riga H- cellule bersaglio (104 cellule/100 μL) incubate con l'1% np-40 (NP-40 lisi le cellule bersaglio, generando "rilascio massimo o totale di 51Cr"). Ogni rapporto E:T viene testato in triplice copia per ogni condizione sperimentale. Colonna 1-3- PBMC non stimolati e COLONNA 4-6- PBMC stimolati da CpG.
<ol start="3"><li>Successivamente, generare una diluizione seriale di cellule 2X dei PBMC (in triplice copia per ogni condizione sperimentale), per ottenere una concentrazione di cellule emotrici che va da 5x105 a 15.625 celle / 100 μL di media (qui righe da B a G). Nota: In questo esempio, il rapporto effettore iniziale: cella target (E: T) è 50:1. Tuttavia, questo rapporto può essere regolato in base alle specifiche sperimentali.
</li>
	<li>Lasciare vuota l'ultima riga (qui riga H) non aggiungendo alcuna celle effettore a questi pozzi. (Questa riga verrà utilizzata per generare il "conteggio totale/min, o (c. p.m)" o il "massimo 51Cr release").</li>
	<li>Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37°C fino a quando le cellule bersaglio non sono pronte per essere aggiunte.</li>
</ol>3. Aggiunta di 51cellule bersaglio WM793 etichettate Cr al test
<ol><li>Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali 51Cr in eccesso.</li>
	<li>Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min, utilizzando una centrifuga designata.</li>
	<li>Rimuovere il lavaggio FBS (surnatante radioattivo) in un contenitore di rifiuti appropriato.</li>
	<li>Ripetere la fase di lavaggio risussoso il pellet in un fresco 5 ml di FBS.</li>
	<li>Centrifugare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 min.</li>
	<li>Infine, risusedipere il pellet in 10 ml di mezzo completo.</li>
	<li>Versare la sospensione di celle WM793 marcata 51Cr (105 celle/ml) in un serbatoio di reagente monouso.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 100 μL di queste cellule bersaglio etichettate, a ciascun pozzetti della piastra cellulare effettore a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 100 μL di NP-40 all'1% (in acqua) alla fila di pozzi privi di cellule emotrici (qui riga H). L'1% np-40 solcherà le cellule bersaglio, e quindi questi pozzi serviranno come controlli per determinare il "conteggio totale / min, o (c. p.m)" o il rilascio massimo di 51Cr.</li>
	<li>Fissare il coperchio alla piastra aggiungendo un piccolo pezzo di nastro permeabile al gas su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene 51Cr.</li>
	<li>In breve, centrifugare la piastra a 1200 giri / min. Se viene utilizzata una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Nota: È importante utilizzare una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi.
</li>
	<li>Rimuovere la piastra dalla centrifuga.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 ° C con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sulla piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire la lisi delle cellule bersaglio. Nota: Il periodo di incubazione può variare da 4 a 18 ore a seconda delle cellule emotrici utilizzate e del potenziale meccanismo di uccisione impiegato.
</li>
</ol>4. Raccolta dei Supernatanti
<ol><li>Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio.</li>
	<li>Quindi, posizionare il telaio di raccolta sul piatto, assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ciò garantirà la raccolta di un surnatante privo di cellule.</li>
	<li>Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzi.</li>
	<li>Dopo circa 10 secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone e quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo.</li>
	<li>Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario.</li>
	<li>Infine, caricare i tubi FACS sul contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di 51Cr rilasciati in ciascuna condizione. I campioni vengono in genere misurati per 1 minuto, consentendo una facile determinazione dei "conteggi / minuto".</li>
	<li>Registrare con attenzione l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime tre colonne e i PBMC stimolati da CpG (CpG ODN, (1 μg / mL) per 24 h) sono stati aggiunti alle colonne 4-6. Cfr. tabella 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Un</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Io</td>
			<td colspan="2">Media di A1,A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>C.p.m spontaneo</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">Media di B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Okay</td>
			<td colspan="2">Media di C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>L</td>
			<td colspan="2">Media di D1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>M</td>
			<td colspan="2">Media di E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">Media di F1,F2,F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">Media di G1,G2,G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>P</td>
			<td colspan="2">Media di H1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>Massimo c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-stim PBMC</td>
			<td>Rapporto E:T</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: 51Dati del saggio di rilascio cr: Valori dei dati 'Counts per minute' / 'c. p.m', valori medi c. p.m e valori di lisi specifici della percentuale calcolata.
<ol start="2"><li>I dati raccolti (conteggi al minuto, cioè .c.p.m) sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale.</li>
	<li>In primo luogo, sono state calcolate le medie dei triplicati. Tabella 2 - cellule da I3 a P3, per PBMC non stimolati e cellule da I6 a P6, per PBMC stimolati da CpG.</li>
	<li>Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione è stata calcolata utilizzando la seguente formula: <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>La percentuale di lisi specifica è stata calcolata per ogni condizione (Tabella 2 - cellule da J4 a O4, per PBMC non stimolati e da J7 a O7, per PBMC non stimolati).</li>
</ol>

Il test qui descritto ha una notevole flessibilità, in quanto è possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici e bersaglio a seconda della domanda posta. Ad esempio, la specificità delle cellule emotrici può essere determinata utilizzando diverse cellule bersaglio o il meccanismo di uccisione delle cellule emotrici può essere determinato utilizzando cellule carenti di proteine specifiche o utilizzando inibitori specifici della proteina. Un problema importante con il test di rilascio di 51Cr è il potenzia...

saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Fonte: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3e Thomas S. Griffith1,2,3,4 1 Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455 2 Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455 3 Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455 4 Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Una delle funzioni principali delle cellule del sistema immunitario è quella di rimuovere le cellule bersaglio che sono state infettate da virus o hanno subito la trasformazione in una cellula tumorale. I saggi in vitro per misurare la capacità citotossica delle cellule immunitarie sono stati un punto fermo nei laboratori per molti anni. Questi saggi sono stati utilizzati per determinare la capacità delle cellule T, delle cellule NK o di qualsiasi altra cellula immunitaria di uccidere le cellule bersaglio in modo antigene-specifico o non specifico. I ligandi di morte (ad esempio, ligando fas o TRAIL), le citochine (ad esempio, IFNg o TNF) o i granuli citotossici (ad esempio, perforina / granzima B) espressi dalle cellule emotrici sono alcuni modi in cui la morte delle cellule bersaglio può essere indotta. Con l'esplosione della ricerca sull'immunoterapia tumorale negli ultimi anni, c'è un crescente interesse nella ricerca di agenti per aumentare l'attività citotossica delle cellule immunitarie per migliorare i risultati dei pazienti. Al contrario, alcune malattie sono caratterizzate dall'attività esuberante dell'attività citotossica delle cellule immunitarie, con conseguenti sforzi per identificare gli agenti per temperare queste risposte. Pertanto, avere un test in cui l'utente può facilmente integrare qualsiasi numero di diverse cellule emotrici, cellule bersaglio e / o modificatori di risposta nel progetto sperimentale può servire come mezzo prezioso per valutare rapidamente la capacità citotossica delle cellule emotrici e / o la reattività della cellula bersaglio.
Questi saggi in vitro comportano la miscelazione di diverse popolazioni cellulari, oltre a utilizzare un numero relativamente basso di cellule emotrici e bersaglio. Pertanto, una necessità del test è quella di etichettare le cellule bersaglio in un modo che possa essere facilmente rilevato e quantizzato, consentendo all'utente di determinare quindi la "lisi specifica percentuale" mediata dalle cellule emotrici. La radioattività - in particolare, il cromo 51 (51Cr) sotto forma di Na251CrO4- è un modo economico per etichettare rapidamente e in modo non specifico le proteine cellulari all'interno delle cellule bersaglio (1). La breve etichettatura e i tempi totali del test riducono il potenziale di cambiamenti significativi nel numero e/o nel fenotipo delle cellule bersaglio, che potrebbero influenzare l'esito del test. Dopo la perdita dell'integrità della membrana delle cellule bersaglio a causa dell'attività citotossica delle cellule emotrici, le 51proteine cellulari marcate con Cr all'interno delle cellule bersaglio vengono rilasciate nel surnatante di coltura, diventando disponibili per la quantificazione. Come con qualsiasi test che esamina la funzione delle cellule immunitarie in vitro, ci sono una serie di considerazioni importanti da considerare per migliorare le prestazioni dell'esperimento. Una delle caratteristiche più critiche è quella di utilizzare cellule emocromatrici sane (per la massima attività citotossica) e target (per la massima reattività e la minima morte spontanea /rilascio di 51Cr). È necessario il contatto tra effettore e cellula bersaglio (che porta all'uso comune di piastre a 96 pozzi a fondo tondo per incoraggiare il contatto cellula-cellula) (2). Infine, l'analisi dei dati dipende dall'inclusione di popolazioni di cellule bersaglio di controllo positive e negative.
Il seguente protocollo delineerà i passaggi per l'esecuzione di un test standard di rilascio di 51Cr per misurare la capacità citotossica di una popolazione di cellule emotrici, sebbene sia stata recentemente sviluppata una versione non radiativa che utilizza Europium. 51 anni Cr è un potente emettitore di radiazioni γ. Di conseguenza, l'uso di questo test richiede un'adeguata formazione sulla sicurezza delle radiazioni, uno spazio di laboratorio dedicato, un contatore gamma e lo smaltimento di campioni radioattivi.
La sequenza generale degli eventi in questo test sono: 1) preparare 51bersagli etichettati con Cr; 2) preparare le cellule emotrici e aggiungerle alla piastra mentre le cellule bersaglio sono etichettate; 3) aggiungere bersagli etichettati alla piastra; 4) piastra di incubazione; 5) raccogliere supernatanti; e 6) analizzare i dati dopo aver eseguito i campioni sul contatore. I campioni sono comunemente preparati in triplice copia e quindi mediati per tenere conto di eventuali sottili differenze di pipettaggio.
Un DPI adeguato è importante per questo test. In particolare, l'utente deve indossare un camice da laboratorio e guanti. Gli occhiali di sicurezza possono essere richiesti in base al laboratorio o all'istituzione. Ci dovrebbe essere un'ampia schermatura al piombo per la conservazione sicura e l'uso del 51Cr durante tutte le fasi. Infine, ci dovrebbero essere spazi di laboratorio dedicati e attrezzature riservate all'utilizzo di 51Cr, compresa tutta la segnaletica appropriata per indicare dove vengono conservati i campioni con 51Cr e un contatore Geiger dotato di sonda gamma per esaminare lo spazio per possibili contaminazioni.
In questo esercizio di laboratorio, determineremo la capacità delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) (CpG stimolate vs. non stimolate) di uccidere le cellule di melanoma, utilizzando la linea cellulare del melanoma umano WM793 come modello e il test di rilascio del cromo.

In questo esempio, le cellule emotrici stimolate con CpG (Figura 1, cerchi neri)hanno ucciso le cellule bersaglio in modo più efficace, poiché il rapporto tra cellule emotrici e cellule bersaglio è aumentato. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate (cerchi bianchi), indicando che la stimolazione CpG è necessaria per l'aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.
<img alt="Figure 1...

Saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

In questo video osserverai come eseguire il saggio di rilascio del cromo e determinare il potenziale citotossico delle cellule effettrici. Le cellule immunitarie sono responsabili dell'identificazione e della rimozione di cellule potenzialmente dannose, come il cancro o le cellule infettate da virus, dal corpo, che è parte integrante della risposta immunitaria. Diverse cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK, possiedono una proprietà nota come potenziale citotossico, che è la capacità di identificare le cellule bersaglio e secernere proteine che inducono la degradazione, la lisi e la morte delle proteine di tali cellule bersaglio. La quantificazione del potenziale citotossico è fondamentale per misurare l'attivazione e la potenza delle cellule immunitarie e il test di rilascio del cromo è comunemente utilizzato per questo scopo. Questo metodo consente agli utenti di confrontare la citossicità indotta da specifici tipi di cellule immunitarie in condizioni diverse, il che è prezioso per studiare l'immunoterapia del cancro e le malattie correlate all'immunità. Per cominciare, le cellule bersaglio, come le cellule tumorali, vengono incubate con un isotopo radioattivo, il cromo 51, che viene assorbito dalle cellule. Successivamente, queste cellule radiomarcate vengono co-coltivate con le cellule immunitarie isolate di interesse, chiamate anche cellule effettrici, in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti per facilitare l'interazione tra i due tipi di cellule. La configurazione generale del test prevede l'incubazione di un numero specifico di cellule bersaglio con diverse concentrazioni di cellule immunitarie, insieme a controlli appropriati. La co-coltura consente alle cellule effettrici di indurre l'apoptosi e la lisi nelle cellule bersaglio, con conseguente rilascio del cromo 51 intracellulare nel surnatante. Quindi, in un momento pre-ottimizzato, il surnatante contenente il cromo rilasciato viene raccolto da tutti i pozzi. Il cromo 51, essendo radioattivo, subisce spontaneamente un decadimento radioattivo per emettere radiazioni gamma. I livelli di radiazione gamma nei surnatanti provenienti da tutti i pozzetti della piastra di saggio rappresentano un output quantificabile della lisi delle cellule bersaglio. Questo viene misurato utilizzando un contatore gamma, che viene poi utilizzato per determinare il potenziale citotossico delle cellule immunitarie. Per iniziare, le cellule bersaglio, la linea cellulare di melanoma umano WM793 in questo esempio, vengono preparate in una sospensione di una singola cellula. Per fare ciò, rimuovere prima il terreno dal pallone di coltura tissutale e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS 1X. Decantare il PBS e poi aggiungere un millilitro di tripsina alla piastra per circa due minuti. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le celle dalla superficie del pallone, quindi aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI al pallone. Pipettare il terreno su e giù per raccogliere le cellule e aggiungere questa sospensione a una provetta conica da 15 millilitri. Mettere la provetta nella centrifuga per cinque minuti a 1200 giri/min. Quindi, rimuovere il supporto dal tubo assicurandosi di non rompere il pellet della cella. Muovere delicatamente il fondo della provetta per rompere il pellet cellulare e aggiungere 10 millilitri di terreno alla provetta. Quindi, pipettare delicatamente il terreno su e giù per portare le cellule in sospensione. Successivamente, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire due millilitri della sospensione cellulare originale in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Mettere la provetta in una centrifuga e pellettare le celle a 12 cento giri/min per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, versare il terreno in eccesso dalla provetta in un contenitore per rifiuti. Agitare brevemente il tubo per risospendere il pellet di cella nel piccolo volume di terreno rimasto. Successivamente, preparati a utilizzare il cromo 51 spostandoti in uno spazio di laboratorio dedicato a questa particolare radioattività. Dovrebbe esserci un'ampia schermatura in piombo per la conservazione e l'uso sicuri del cromo 51 durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con cromo 51. E' inoltre necessario un contatore Geiger dotato di sonda pancake per servire nello spazio per eventuali contaminazioni. Una volta impostato per l'uso corretto della radioattività, aggiungere 100 microcurie di cromo 51 direttamente alla sospensione della cellula target. Quindi, aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo alla provetta per indicare che il campione e la provetta sono ora radioattivi. Posizionare la provetta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con uno schermo di piombo e incubare per un'ora, muovendo la provetta ogni 15-20 minuti. Mentre le cellule bersaglio stanno etichettando, preparare una sospensione a cellula singola di cellule effettrici. In questo esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico umano, o PDMC, sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard a una concentrazione di 5 volte 10 alla 6a. Trasferire questa sospensione di cellule effettrici in un serbatoio di reagenti monouso e quindi aggiungere 200 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto della fila B in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di RPMI a ciascun pozzetto nella fila da C a G della piastra. Ora, inizia a eseguire diluizioni seriali delle PBMC per avere un intervallo di numeri di cellule effettrici rimuovendo prima 100 microlitri di cellule nei pozzetti nella riga B e aggiungendoli alla riga C. Quindi, diluire ulteriormente le cellule effettrici trasferendo 100 microlitri di cellule dalla fila C alla fila D. Continuare la diluizione seriale. Una volta raggiunta la fila G, spostare 100 microlitri dai pozzetti per lasciare un volume finale di 100 microlitri in ogni pozzetto di quella fila. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura tissutale ai pozzetti della fila A per fungere da controllo per il rilascio spontaneo di cromo 51 dalle cellule bersaglio, poiché non devono essere aggiunte cellule effettrici a questa fila. Quindi, posizionare una piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule target non sono pronte per essere aggiunte. Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 millilitri di FBS per rimuovere l'eccesso di Cromo 51. Quindi, posizionare la provetta in una centrifuga designata e centrifugare a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il lavaggio FBS radioattivo in un contenitore di rifiuti appropriato e ripetere la fase di lavaggio rimettendo il pellet in 5 millilitri di FBS freschi. Posizionare la provetta in una centrifuga designata e far girare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 minuti. Rimuovere il secondo lavaggio e controllare la radioattività incorporata del pellet utilizzando un contatore Geiger. Infine, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno completo e versare la sospensione di cellule bersaglio marcata con cromo 51 in un serbatoio di reagenti monouso. Quindi, aggiungere 100 microlitri di queste cellule bersaglio marcate a ogni pozzetto della piastra cellulare effettrice a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di NP-40 all'1% in acqua ai pozzetti della fila H per lisare tutte le cellule bersaglio in ogni fila. Questi pozzetti verranno utilizzati come controllo per determinare i conteggi totali al minuto, o cpm. Ora che la piastra è pronta, fissare il coperchio aggiungendo un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene cromo 51. Quindi, posizionare la piastra in una centrifuga contrassegnata per la manipolazione di campioni radioattivi. Se si utilizza una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Impostare la centrifuga a 1200 giri/min e portare la piastra alla velocità. Una volta raggiunta la velocità, arrestare la macchina. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Quindi, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sopra la piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire alle cellule bersaglio di lisarsi. Al termine del periodo di incubazione, rimuovere con cautela il nastro adesivo attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio. Quindi, posiziona il telaio di raccolta sulla piastra assicurandoti di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ora, premi lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzetti. Dopo circa dieci secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone, quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo. Posizionare ciascuna di queste provette in una provetta FACS secondaria. Infine, caricare le provette FACS su un contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di cromo 51 rilasciata in ciascuna condizione. Registrare attentamente l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel bancone. Qui, le PBMC non stimolate sono state aggiunte alle prime 3 corsie e le PMBC stimolate CPG sono state aggiunte alle corsie da 4 a 6. In questo esempio, i conteggi al minuto sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale e sono state calcolate le medie dei triplicati. Ad esempio, per la prima condizione, le celle A1, A2 e A3 sono state mediate nella cella I3. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione può essere calcolata utilizzando questa formula. Ad esempio, per calcolare la percentuale di lisi specifica per le cellule non stimolate che avevano un rapporto di 50 a 1 tra cellule effettrici e cellule bersaglio, il CPM spontaneo, che in questo esempio è 1164,67, è stato sottratto dal CPM sperimentale, 1129. 67. Questo numero può quindi essere diviso per la differenza tra il CPM massimo e il CPM spontaneo, e quindi moltiplicato per 100 per ottenere la percentuale di lisi specifica. Questo viene quindi calcolato per ogni condizione. Questi dati possono quindi essere rappresentati graficamente per mostrare il confronto del rapporto E/T con la percentuale di lisi specifica sia per le PBMC non stimolate che per le PBMC stimolate CPG. In questo esempio, le cellule effettrici stimolate con CPG hanno ucciso più efficacemente le cellule bersaglio all'aumentare del rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate, indicando che la stimolazione CPG è necessaria per l'aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Questa collezione include molte tecniche di base dei laboratori di immunologia, tra cui il labeling e il cell sorting delle cellule immunitarie. Mostra anche i metodi di propagazione per cellule immunitarie e anticorpi, così come i saggi più comuni per l'attività immunitaria tra cui l'ELISA. Infine, illustra la colorazione e l'imaging di campioni di tessuti e cellule immunitarie.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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