Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Buffer

Concetti Preparazione dell’insegnante Protocollo per gli studenti

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I tamponi sono soluzioni che lavorano per mantenere un pH costante in un sistema indipendentemente dall'aggiunta di acidi o basi forti. In assenza di tamponi, l'aggiunta di un acido forte o di una base a una soluzione modifica significativamente il pH. I tamponi sono fondamentali nella vita di tutti i giorni. Ad esempio, il sangue funge da tampone ed è in grado di mantenere un pH compreso tra 7,35 e 7,45 poiché un pH superiore a 7,8 o inferiore a 6,8 può causare la morte.

Quindi, come funziona un buffer? Un tampone è essenzialmente un acido o una base debole e la sua base o acido coniugato in equilibrio tra loro. Prendiamo, ad esempio, un tampone fatto di acido acetico e acetato di sodio. La soluzione tampone contiene un acido debole e il suo sale coniugato, che si dissocia per formare l'acetato di base coniugato. La soluzione è acida perché il K_a dell'acido acetico è superiore al K_b della base coniugata.

Ricorda che la costante di dissociazione, K_a o K_b, definisce la forza dell'acido o della base, rispettivamente, in quanto è la costante di equilibrio per la dissociazione del composto in acqua. La costante di dissociazione può anche essere rappresentata come pK_a, o il log negativo di K_a, dove più piccolo è il pK_a, più forte è l'acido. Lo stesso vale per pK_b, dove più piccolo è il pK_b, più forte è la base.

Tornando al tampone acetato, se aggiungiamo una base forte, come l'idrossido di sodio, gli ioni idrossido reagiscono con gli ioni idronio presenti nella soluzione. Questo fa sì che più acido acetico reagisca con l'acqua per tornare all'equilibrio, formando così più ioni idronio. Se aggiungiamo un acido forte, come l'acido cloridrico, si formano più ioni idronio in soluzione. Questi ioni reagiscono con gli ioni acetato per formare più acido acetico. In entrambi i casi, il pH della soluzione è molto piccolo.

Tieni presente che ogni tampone ha un intervallo di pH specifico in cui può tamponare una soluzione. Qui mostriamo una curva di titolazione per il nostro tampone di acido acetico. L'intervallo di buffering è evidenziato. Questa regione è determinata dall'equazione di Henderson-Hasselbalch, che ci dice che il pH del tampone è determinato dal K_a dell'acido debole e dal rapporto tra la base coniugata e l'acido debole.

Lontano da questo pH, l'acido debole o la base del tampone è esaurito e non può tamponare il pH. Quindi, quando selezioni un tampone per la tua applicazione, scegline uno il cui pK_a sia vicino al pH desiderato.

Infine, tutti i tamponi hanno un limite alla loro capacità tampone, ovvero la quantità di acido o base che può essere aggiunta alla soluzione tampone prima che il pH cambi in modo significativo. Ad esempio, se aggiungiamo troppo acido alla nostra soluzione tampone di acido acetico e acetato di sodio, protoneremo tutti gli ioni acetato e accumuleremo molti ioni idronio, abbassando così il pH.

Allo stesso modo, se aggiungiamo troppa base, deprotoneremo tutto l'acido acetico e accumuleremo molti ioni idrossido, aumentando così il pH. Pertanto, la capacità tampone è influenzata dalla concentrazione dell'acido debole e del sale coniugato. Quindi, un tampone acetato 1 molare ha una capacità tampone maggiore rispetto a un tampone acetato 0,1 molare.

In questo laboratorio, preparerai ed esaminerai tamponi con un'ampia varietà di intervalli di pH. Utilizzerai quindi i tuoi tamponi per determinare il pK_a di un indicatore di pH, chiamato rosso neutro, ed esplorerai la variazione del pK_a del rosso neutro quando viene introdotta la proteina legante la riboflavina.

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Fonte: Smaa Koraym presso la Johns Hopkins University, MD, USA

Preparazione di 50 mM NaH₂PO₄ Tampone, pH 7

Nella prima parte di questo esperimento, preparerai una soluzione di fosfato di sodio tamponata a pH 7,0. Il fosfato monosodico è un acido debole con la base coniugata, fosfato disodico. Le soluzioni di fosfato monosodico non aggiustato di solito hanno un pH di circa 4 - 6.

I tamponi sono più efficaci vicino al loro pKa, che è compreso tra 6,8 e 7,2 per il fosfato monosodico. Quindi, utilizzerai NaOH per spingere l'equilibrio verso la base coniugata senza alterare la composizione complessiva dell'equilibrio tampone.

Prima di iniziare l'esperimento, calcola la massa di fosfato monosodico di cui avrai bisogno per produrre 200 mL di una soluzione da 50 mM.

Tabella 1: Preparazione di 50 mM di NaH₂PO₄, pH 7,0

Massa molare di NaH₂PO₄ = 119.98 g/mol
Volume della soluzione (mL)	200
Molarità (mM)	50
Talpe di NaH₂PO₄ (mol)
Massa necessaria (mg)
Volume iniziale di 1 M NaOH (mL)
Volume finale di 1 M NaOH (mL)
Volume di NaOH utilizzato (mL)
Volume di acqua deionizzata necessaria (mL)

Clicca qui per scaricare la Tabella 1

Per iniziare, indossa i dispositivi di protezione individuale necessari, tra cui un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza resistenti agli schizzi e guanti. nota: Questa sezione del laboratorio utilizza NaOH, che è corrosivo e tossico. Prestare attenzione durante il versamento e il trasporto di NaOH.
Riempi una bottiglia di plastica da 250 ml con acqua deionizzata.
Etichetta due becher da 100 ml, uno per i rifiuti acquosi neutri e uno per i rifiuti acquosi basici.
Calibra il tuo misuratore di pH utilizzando i tamponi forniti. Al termine, riporre la sonda nella sua soluzione di archiviazione.
la carta per pesare e usa una spatola pulita per misurare la quantità richiesta di fosfato monosodico secondo i tuoi calcoli. Registra la quantità esatta di fosfato monosodico sul tuo quaderno di laboratorio. nota: Il fosfato monosodico assorbe l'umidità dall'aria, quindi lavora rapidamente per ottenere una misurazione accurata e chiudi bene il contenitore quando hai finito.
Metti il fosfato monosodico in un becher da 400 ml e pulisci la spatola con una salvietta da laboratorio. Gettare via la carta per pesare e la salvietta da laboratorio prima di rimettere la cappa aspirante.
Usa un cilindro graduato per misurare 175 ml di acqua deionizzata. Versare l'acqua nel becher di fosfato monosodico e aggiungere un'ancoretta magnetica.
Mescola la soluzione fino a quando il sale non si è completamente sciolto e la soluzione appare omogenea. Questo di solito richiede 2 - 3 minuti.
Misura 15 ml di acqua deionizzata e versala nel becher. Continuare a mescolare la soluzione fino a quando non appare di nuovo omogenea (circa 1 – 2 min). Spegnere il motore di agitazione.
Sciacquare la sonda di pH con acqua deionizzata, e poi bloccarla nella soluzione con il sensore sopra la barra di agitazione.
Porta un cilindro graduato da 10 ml e guarda il vetro alla cappa di erogazione e misura 10 ml di NaOH da 1 M. Annotare il volume esatto nel cilindro graduato.
Copri il tuo NaOH con il vetro dell'orologio e portalo con cura alla tua cappa aspirante.
Riprendi ad agitare la soluzione di fosfato monosodico. Durante il monitoraggio della lettura del pH, utilizzare una pipetta monouso per aggiungere lentamente NaOH alla soluzione di agitazione in modo gocce. Una volta che il pH del tampone raggiunge 7,0, reinserire il NaOH ancora nella pipetta nel cilindro graduato.
Calcola il volume di NaOH che hai aggiunto al buffer. Sottrai quel volume da 10 ml per determinare quanta acqua deionizzata devi aggiungere al tuo tampone per raggiungere un volume totale di soluzione di 200 ml.
Misura l'acqua deionizzata con un altro cilindro graduato da 10 ml e aggiungila alla soluzione di agitazione per finire di fare il tampone.
Sciacquare il sensore di pH con acqua deionizzata, coprirlo con il tappo pieno di soluzione di conservazione e scollegare o spegnere la sonda.
Etichetta un flacone di polietilene da 250 ml come 'tampone fosfato monosodico da 50 mM, pH 7.0'. Recuperare l'ancoretta magnetica dalla soluzione.
Usa un imbuto per versare la soluzione tampone nella bottiglia etichettata e tapparla bene.

>Spettroscopia di Assorbimento del Rosso Neutro Libero e Legato
I tamponi possono essere utilizzati per valutare i composti a specifici valori di pH. In questa sezione, registrerai lo spettro di assorbanza dell'indicatore rosso neutro in vari tamponi. La forma protonata del rosso neutro è rossa e la forma deprotonata è giallo-arancio, il che significa che assorbono rispettivamente la luce verde e blu-viola. Pertanto, le forme acide e basiche hanno lunghezze d'onda di assorbimento distinte. Il legame proteico altera le proprietà del rosso neutro, modificando sia la sua assorbanza che il suo pKa.

Dopo aver misurato lo spettro di assorbanza del rosso neutro libero a diversi valori di pH, si aggiungerà la proteina legante la riboflavina, o RP, alle soluzioni e si misureranno nuovamente le assorbanze. L'intensità dell'assorbanza è correlata alla concentrazione, quindi utilizzerai gli spettri per determinare il pKa del rosso neutro libero e legato dopo il laboratorio.
- Disegna la seguente tabella nel tuo quaderno di laboratorio. Numera le cuvette da 1 a 10 ed elenca i nove valori di pH del tampone che utilizzerai. La decima cuvetta sarà un bianco d'acqua deionizzata. nota: Tenere sempre le cuvette per i lati testurizzati e pulire i lati trasparenti appena prima di inserire la cuvetta nello spettrofotometro. Ricordarsi di allineare i lati trasparenti con il fascio di luce nello spettrofotometro.
  Tabella 2: Assorbanza del rosso neutro libero e legato
  
  Cuvetta # Tampone pH Abs. a λ_max(NRH⁺ libero) Abs. a λ_max (NRH legato)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 vuoto
  Clicca qui per scaricare la Tabella 2
- Ottieni dieci cuvette e tappi da 1,5 ml ed etichetta i tappi da 1 a 10 in modo che corrispondano alla tabella nel tuo quaderno di laboratorio.
- Etichetta un becher da 25 ml come 'DIH2O' e riempilo con acqua deionizzata.
- Getta i tuoi rifiuti acquosi neutri nello scarico e rietichetta il becher come 'rifiuti tampone acquosi'.
- Etichetta un becher da 400 ml per i puntali per micropipette usati.
- Attacca un puntale a una micropipetta da 1 ml e usalo per erogare 1000 μL di acqua deionizzata nella cuvetta 10. Questo è il tuo solvente grezzo.
- Posiziona 925 μL del tuo tampone fosfato monosodico pH 7.0 nella cuvetta 5.
- Porta le cuvette vuote rimanenti nella tabella del buffer. Guidati dalla tabella del taccuino di laboratorio, erogare 925 μl di ciascun tampone nella cuvetta appropriata utilizzando le micropipette etichettate. Fare attenzione a non utilizzare lo stesso puntale per pipette per tamponi diversi.
- Una volta terminato, riporta i buffer sul tuo banco di lavoro. A questo punto, impostare una micropipetta da 200 μl per erogare 75 μl e collegare un puntale alla micropipetta.
- Dispensa 75 μL di rosso neutro in ciascuna delle nove cuvette tampone. Capovolgere più volte ogni cuvetta per mescolare accuratamente le soluzioni. nota: Sostituire il puntale della pipetta se tocca un tampone.
- Una volta che hai mescolato il rosso neutro con ogni buffer, scatta una foto o annota i colori delle soluzioni.
- Accendi uno spettrofotometro portatile e lascia che la sorgente luminosa si riscaldi. Una volta pronto, crea un nuovo esperimento per misurare l'assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda per il rosso neutro libero.
- Inserisci la cuvetta di acqua deionizzata e acquisisci uno spettro dell'acqua deionizzata. Impostalo come sfondo solvente o vuoto.
- Allora, rimuovi il bianco e inserisci la cuvetta di rosso neutro nel tampone a pH più basso, che avrà la più alta concentrazione di rosso neutro protonato.
- Acquisisci uno spettro, che dovrebbe mostrare un picco forte. Identificare la lunghezza d'onda corrispondente al punto più alto di questo picco, o al massimo. Registra questa lunghezza d'onda nel tuo quaderno di laboratorio come lambda max per il rosso neutro libero protonato.
- Salva i dati e rimuovi la cuvetta. Registrare l'assorbanza sul taccuino, quindi raccogliere gli spettri per le cuvette 2 - 9 utilizzando la stessa procedura.
- Registra la lunghezza d'onda del punto isosbestico nel tuo quaderno di laboratorio. È qui che tutti gli spettri si incrociano a una singola lunghezza d'onda. Se uno spettro non attraversa a quel punto, svuotare e pulire la cuvetta, preparare un nuovo campione e riprovare.
- Una volta terminata la raccolta degli spettri per tutte e nove le cuvette, salva ed esporta i dati.
- Crea un nuovo esperimento per misurare l'assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda per il rosso neutro legato.
- Montare un nuovo puntale sulla micropipetta da 200 μL e aggiungere 75 μL di soluzione proteica legante la riboflavina a ciascuna cuvetta, compreso il bianco. Espellere la punta, fissare i cappucci della cuvetta e capovolgere la cuvetta più volte per mescolare le soluzioni.
- Inserisci la cuvetta 10 nello spettrofotometro e impostala come bianco del solvente.
- Acquisisci uno spettro del campione di pH più basso e identifica la lunghezza d'onda corrispondente al picco massimo o più intenso. Registralo nel tuo quaderno di laboratorio come lambda max di rosso neutro legato al protonato.
- Acquisisci spettri per le cuvette 2 - 9 nello stesso modo in cui hai fatto per i campioni rossi neutri gratuiti. Registra le intensità al massimo lambda per il rosso neutro legato al protonato nella tua tabella, insieme alla lunghezza d'onda al punto isosbestico.
- Quando hai finito, salva i tuoi dati, esportali per un'analisi successiva e spegni lo spettrofotometro.
- Metti via tutta l'attrezzatura e smaltisci i tuoi puntali per pipette usati in un contenitore per rifiuti o in un bidone della spazzatura approvato.
- Svuota le cuvette nel bicchiere di scarto tampone acquoso e sciacqua le cuvette nel bicchiere con acqua deionizzata.
- Svuota il NaOH in eccesso nei rifiuti di base e risciacqua il cilindro graduato con acqua.
- Getta i rifiuti acquosi di base nello scarico con abbondante acqua di rubinetto, insieme agli altri rifiuti acquosi.
- Lava la tua vetreria, i tappi delle cuvette e la barra di agitazione secondo le procedure standard del tuo laboratorio. Pulisci le superfici di lavoro con un tovagliolo di carta umido e getta i tovaglioli di carta usati e le salviette da laboratorio nella spazzatura del laboratorio.
Risultati
Ora, analizziamo i nostri dati di assorbanza per determinare i pKa del rosso neutro.

Tabella 3: Determinazione dei pKa rossi neutri

NRH⁺ gratuito NRH⁺ vincolato
λ_max (nm)
ΔA (nm)
Punto medio (nm)
pKa

Clicca qui per scaricare la Tabella 3
- Traccia entrambi i set di dati di intensità con intensità di assorbanza a lambda max sull'asse y e pH sull'asse x, con i punti uniti da linee morbide.
- Calcola la differenza tra l'intensità di assorbanza iniziale e finale per ogni serie di dati.
- Determina l'assorbanza a metà strada tra le assorbanze iniziali e finali per ogni serie, o i punti medi dell'assorbanza.
- Trova dove si trova il punto medio su ogni linea e identifica il valore del pH in quel punto. Questi valori di pH sono i pKa del rosso neutro libero e legato.
- Qui, vediamo un aumento del pKa di circa uno tra il rosso neutro libero e quello neutro legato, indicando che il rosso neutro protonato legato è un acido più debole del rosso neutro protonato libero di un ordine di grandezza.