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Fonte: Smaa Koraym presso la Johns Hopkins University, MD, USA
Nella prima parte di questo esperimento, preparerai una soluzione di fosfato di sodio tamponata a pH 7,0. Il fosfato monosodico è un acido debole con la base coniugata, fosfato disodico. Le soluzioni di fosfato monosodico non aggiustato di solito hanno un pH di circa 4 - 6.
I tamponi sono più efficaci vicino al loro pKa, che è compreso tra 6,8 e 7,2 per il fosfato monosodico. Quindi, utilizzerai NaOH per spingere l'equilibrio verso la base coniugata senza alterare la composizione complessiva dell'equilibrio tampone.
| Massa molare di NaH2PO4 = 119.98 g/mol | |
| Volume della soluzione (mL) | 200 |
| Molarità (mM) | 50 |
| Talpe di NaH2PO4 (mol) | |
| Massa necessaria (mg) | |
| Volume iniziale di 1 M NaOH (mL) | |
| Volume finale di 1 M NaOH (mL) | |
| Volume di NaOH utilizzato (mL) | |
| Volume di acqua deionizzata necessaria (mL) | |
I tamponi possono essere utilizzati per valutare i composti a specifici valori di pH. In questa sezione, registrerai lo spettro di assorbanza dell'indicatore rosso neutro in vari tamponi. La forma protonata del rosso neutro è rossa e la forma deprotonata è giallo-arancio, il che significa che assorbono rispettivamente la luce verde e blu-viola. Pertanto, le forme acide e basiche hanno lunghezze d'onda di assorbimento distinte. Il legame proteico altera le proprietà del rosso neutro, modificando sia la sua assorbanza che il suo pKa.
Dopo aver misurato lo spettro di assorbanza del rosso neutro libero a diversi valori di pH, si aggiungerà la proteina legante la riboflavina, o RP, alle soluzioni e si misureranno nuovamente le assorbanze. L'intensità dell'assorbanza è correlata alla concentrazione, quindi utilizzerai gli spettri per determinare il pKa del rosso neutro libero e legato dopo il laboratorio.
| Cuvetta # | Tampone pH | Abs. a λmax (NRH+ libero) | Abs. a λmax (NRH legato) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | vuoto |
Ora, analizziamo i nostri dati di assorbanza per determinare i pKa del rosso neutro.
| NRH+ gratuito | NRH+ vincolato | |
| λmax (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Punto medio (nm) | ||
| pKa |
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Nella prima parte di questo esperimento, preparerai una soluzione di fosfato di sodio tamponata a pH 7,0. Il fosfato monosodico è un acido debole con la base coniugata fosfato disodico. Le soluzioni di fosfato monosodico non aggiustato di solito hanno un pH compreso tra 4 e 6 circa.
I tamponi sono più efficaci vicino al loro pKa, che è compreso tra 6,8 e 7,2 per il fosfato monosodico. Quindi, utilizzerai l'idrossido di sodio per spingere l'equilibrio verso la base coniugata senza alterare la composizione complessiva dell'equilibrio tampone. Prima di iniziare il laboratorio, calcola la massa di fosfato monosodico di cui avrai bisogno per produrre 200 millilitri di una soluzione da 50 millimolari.
Questa sezione del laboratorio utilizza idrossido di sodio, che è corrosivo e tossico. Prestare attenzione quando si versa e si trasporta l'idrossido di sodio. Ora, iniziamo.
Per prima cosa, indossa un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza resistenti agli schizzi e guanti in nitrile. Quindi, riempi una bottiglia di plastica da 250 millilitri con acqua deionizzata. Etichettare due becher da 100 millilitri rispettivamente per i rifiuti acquosi neutri e basici.
Quindi, calibrare il pHmetro utilizzando i tamponi forniti. Al termine, riporre la sonda nella sua soluzione di archiviazione. A questo punto, portare un becher da 400 millilitri nell'area della bilancia analitica per ottenere il fosfato monosodico di cui avrete bisogno.
Tarare un pezzo di carta per pesare e utilizzare una spatola pulita per misurare la quantità necessaria di fosfato monosodico in base ai calcoli. Il fosfato monosodico assorbe l'umidità dall'aria, quindi lavora rapidamente per ottenere una misurazione accurata e chiudi bene il contenitore quando hai finito. Registra la quantità esatta di fosfato monosodico che misuri nel tuo quaderno di laboratorio.
Quindi, posizionare il fosfato monosodico nel becher e pulire la spatola con una salvietta da laboratorio. Gettare via la carta per pesare e la salvietta da laboratorio prima di rimettere la cappa aspirante. Ora, usa un cilindro graduato per misurare 175 millilitri di acqua deionizzata.
Versare l'acqua nel becher di fosfato monosodico e aggiungere un'ancoretta magnetica. Mescolare la soluzione su una piastra di agitazione fino a quando il sale non si è completamente sciolto e la soluzione appare omogenea. Questo di solito richiede due o tre minuti.
Quindi, misurare 15 millilitri di acqua deionizzata con un cilindro graduato. Versare l'acqua deionizzata nel becher e continuare a mescolare la soluzione fino a quando non appare di nuovo omogenea, operazione che di solito richiede da uno a due minuti. Quindi, spegnere il motore di agitazione.
Sciacquare la sonda di pH con acqua deionizzata, quindi bloccarla nella soluzione con il sensore sopra l'ancoretta di agitazione. Ora, portare un cilindro graduato da 10 millilitri e un vetro dell'orologio alla cappa di erogazione e misurare 10 millilitri di idrossido di sodio da 1 molare. Copri l'idrossido di sodio con il vetro dell'orologio e portalo con cura alla cappa aspirante.
Annotare il volume esatto nel cilindro graduato. Quindi, riprendere ad agitare la soluzione di fosfato monosodico. Durante il monitoraggio della lettura del pH, utilizzare una pipetta monouso per aggiungere lentamente idrossido di sodio alla soluzione di agitazione in modo gocce.
Una volta che il pH del tampone raggiunge 7,0, rimettere l'idrossido di sodio ancora nella pipetta nel cilindro graduato. Quindi, calcola il volume di idrossido di sodio che hai aggiunto dai volumi iniziale e finale nel cilindro graduato. Sottrai quel volume da 10 millilitri per determinare quanta acqua deionizzata devi aggiungere al tuo tampone per raggiungere un volume totale di soluzione di 200 millilitri.
Misura l'acqua deionizzata di cui hai bisogno con un altro cilindro graduato da 10 millilitri e aggiungila alla soluzione di agitazione per finire di preparare il tampone. Sciacquare il sensore di pH con acqua deionizzata, coprirlo con il tappo pieno della soluzione di conservazione e scollegare o spegnere la sonda. Successivamente, etichettare un flacone di polietilene da 250 millilitri come tampone fosfato monosodico da 50 millimolari, pH 7,0'Utilizzare una pinza per recuperare l'ancoretta magnetica dalla soluzione.
Quindi, posizionare un imbuto nella bocca del flacone e versare la soluzione tampone nel flacone. Rimuovere l'imbuto e tappare bene la bottiglia. Ora sei pronto per passare alla sezione della spettroscopia di assorbimento.
I tamponi possono essere utilizzati per valutare i composti a specifici valori di pH. In questa sezione, registrerai lo spettro di assorbanza dell'indicatore rosso neutro in vari tamponi. La forma protonata del rosso neutro è rossa e la forma deprotonata è giallo-arancio, il che significa che assorbono rispettivamente la luce verde e blu-viola.
Pertanto, le forme acide e basiche hanno lunghezze d'onda di assorbimento distinte. Il legame proteico altera le proprietà del rosso neutro, modificando sia la sua assorbanza che il suo pKa. Dopo aver misurato lo spettro di assorbanza del rosso neutro libero a diversi valori di pH, si aggiungerà la proteina legante la riboflavina, o RP, alle soluzioni e si misureranno nuovamente le assorbanze.
L'intensità dell'assorbanza è correlata alla concentrazione, quindi utilizzerai gli spettri per determinare il pKa del rosso neutro libero e legato dopo il laboratorio. Prima di iniziare questa sezione, disegna una tabella nel tuo quaderno di laboratorio, elencando il numero di cuvetta, il pH tampone, l'assorbanza al massimo lambda per il rosso neutro protonato libero e l'assorbanza al massimo lambda per il rosso neutro protonato legato. Numera le cuvette da 1 a 10 ed elenca i nove valori di pH del tampone che utilizzerai.
La decima cuvetta sarà un bianco d'acqua deionizzata. Tenere sempre le cuvette per i lati testurizzati e pulire i lati trasparenti appena prima di inserire la cuvetta nello spettrofotometro. Ricordarsi di allineare i lati trasparenti con il fascio di luce nello spettrofotometro.
Ora, iniziamo. Procurati dieci cuvette e tappi da 1,5 millilitri ed etichetta i tappi da 1 a 10 in modo che corrispondano alla tabella sul tuo quaderno di laboratorio. Etichettare un becher da 25 millilitri come DIH2O' e riempirlo con acqua deionizzata.
Quindi, getta i rifiuti acquosi neutri nello scarico e rietichetta il becher come rifiuto tampone acquoso"Inoltre, etichetta un becher da 400 millilitri per i puntali per micropipette usati. Quindi, collegare un puntale a una micropipetta da 1 millilitro e utilizzarlo per erogare 1000 microlitri di acqua deionizzata nella cuvetta 10. Questo sarà il tuo solvente grezzo.
A questo punto, espellere il puntale, impostare la micropipetta in modo che eroghi 925 microlitri e collegare un nuovo puntale. Metti 925 microlitri del tuo tampone fosfato monosodico pH 7.0 nella cuvetta cinque. Espellere la punta e tappare la cuvetta.
Quindi, portare le cuvette vuote rimanenti nella tabella dei buffer. Guidati dalla tabella del taccuino di laboratorio, erogare 925 microlitri di ciascun tampone nella cuvetta appropriata utilizzando le micropipette etichettate. Fare attenzione a non utilizzare lo stesso puntale per pipette per tamponi diversi.
Una volta terminato, riporta i buffer sul tuo banco di lavoro. Lì, imposta una micropipetta da 200 microlitri per erogare 75 microlitri e attacca un puntale alla micropipetta. Ora, procurati una fiala o un tubo di soluzione rossa neutra, che può essere condiviso con un altro gruppo di studenti.
Erogare 75 microlitri di rosso neutro in ciascuna delle nove cuvette tampone. Sostituire il puntale della pipetta se tocca un tampone. Al termine, espellere il puntale della pipetta e tappare le cuvette.
Ora, capovolgi ogni cuvetta più volte per mescolare accuratamente le soluzioni. Dopo aver mescolato il rosso neutro con ogni tampone, scatta una foto o annota i colori delle soluzioni. Quindi, accendi uno spettrofotometro portatile e attendi che la fonte di luce si riscaldi.
Una volta pronto, crea un nuovo esperimento per misurare l'assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda per il rosso neutro libero. Quindi, inserire la cuvetta di acqua deionizzata. Acquisisci uno spettro dell'acqua deionizzata e impostalo come sfondo solvente o vuoto.
Quindi, rimuovere il bianco dallo spettrofotometro e inserire la cuvetta di rosso neutro nel tampone a pH più basso, che avrà la più alta concentrazione di rosso neutro protonato. Acquisisci uno spettro, che dovrebbe mostrare un picco forte. Identificare la lunghezza d'onda corrispondente al punto più alto di questo picco, o al massimo.
Registra questa lunghezza d'onda nel tuo quaderno di laboratorio come lambda max per il rosso neutro libero protonato. Salvare i dati e rimuovere la cuvetta. Registrare l'assorbanza sul taccuino, quindi raccogliere gli spettri per le cuvette da 2 a 9 utilizzando la stessa procedura.
Gli spettri dovrebbero incrociarsi tutti in un unico punto, chiamato punto isosbetico. Registra la lunghezza d'onda di questo punto nel tuo quaderno di laboratorio. Se uno spettro non attraversa a quel punto, svuotare e pulire la cuvetta, preparare un nuovo campione e riprovare.
Una volta terminata la raccolta degli spettri per tutte e 9 le cuvette, salva ed esporta i dati. Quindi, crea un nuovo esperimento per misurare l'assorbanza rispetto alla lunghezza d'onda per il rosso neutro legato. Inserire un nuovo puntale nella micropipetta da 200 microlitri e ottenere un contenitore condiviso di proteine leganti la riboflavina.
Aggiungere 75 microlitri di soluzione proteica legante la riboflavina a ciascuna cuvetta, compreso il bianco. Espellere la punta, fissare i cappucci della cuvetta e capovolgere la cuvetta più volte per mescolare le soluzioni. A questo punto, inserire la cuvetta 10 nello spettrofotometro e impostarla come bianco del solvente.
Quindi, acquisire uno spettro del campione di pH più basso e identificare la lunghezza d'onda corrispondente al massimo del picco più intenso. Registralo nel tuo quaderno di laboratorio come lambda max di rosso neutro legato al protonato. Dopodiché, acquisisci gli spettri per le cuvette da 2 a 9 nello stesso modo in cui hai fatto per i campioni rossi neutri gratuiti.
Registra le intensità al massimo lambda per il rosso neutro legato al protonato nella tua tabella, insieme alla lunghezza d'onda al punto isosbestico. Al termine, salvare i dati, esportarli per un'analisi successiva e spegnere lo spettrofotometro. Riponi le micropipette, le scatole dei puntali, il pHmetro e lo spettrofotometro.
Smaltisci i puntali per pipette usati in un contenitore per rifiuti o in un cestino approvato. A questo punto, svuotare le cuvette nel becher di scarto tampone acquoso e sciacquare le cuvette nel becher con acqua deionizzata. Nella cappa aspirante, svuotare l'eccesso di idrossido di sodio nei rifiuti di base e sciacquare il cilindro graduato con acqua.
Sciacquare i rifiuti acquosi di base nello scarico con abbondante acqua di rubinetto, insieme agli altri rifiuti acquosi. Lava la vetreria, i tappi delle cuvette e l'ancoretta secondo le procedure standard del tuo laboratorio. Infine, pulisci le superfici di lavoro con un tovagliolo di carta umido e getta i tovaglioli di carta usati e le salviette da laboratorio nella spazzatura del laboratorio.
Ora, analizziamo i nostri dati di assorbanza per determinare i pKa del rosso neutro. Innanzitutto, traccia entrambe le serie di dati di intensità con l'intensità dell'assorbanza al massimo lambda sull'asse y e il pH sull'asse x, con i punti uniti da linee morbide. Quindi, per ogni serie di dati, calcolare la differenza tra l'intensità di assorbanza iniziale e finale.
Usalo per calcolare l'assorbanza a metà strada tra le assorbanze iniziali e finali per ogni serie, o i punti medi dell'assorbanza. Ora, trova dove si trova il punto medio su ogni linea e identifica il valore del pH in quel punto. Questi valori di pH sono i pKa del rosso neutro libero e legato.
Qui, vediamo un aumento di pKa di circa 1 tra il rosso neutro libero e quello neutro legato, indicando che il rosso neutro protonato legato è un acido più debole del rosso neutro protonato libero di un ordine di grandezza.
