Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Summary

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.

Abstract

Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De gist

Protocol

Deel 1: Bereid stammen en platen voor replicatieve levensduur analyse

Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste YEPD platen voor gebruik in de replicatieve levensduur experiment en de voorbereiding van de gistcellen voor de levensduur analyse.

1. Met behulp van geschikte steriele techniek, voor te bereiden YEPD agar platen (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glucose) die zullen worden gebruikt voor het kweken van gistcellen en voor replicatieve levensduur analyse. U moet zich voorbereiden op zijn minst twee platen voor om de 4-5 stammen worden geanalyseerd in de levensduur experiment. De platen moeten bereid minimaal 2 dagen voor de levensduur experiment en laten drogen voor het begin van de levensduur test. Als het experiment niet te worden gestart binnen 4-5 dagen van het gieten van de platen, moeten ze worden geplaatst in een gekoelde incubator en verpakt in parafilm of plastic om uitdroging te voorkomen.
2. Verwijder de giststammen van bevroren voorraden en strook voor enkele kolonies op YEPD agar platen. Tot 6 stammen kunnen gemakkelijk worden strepen op dezelfde YEPD plaat door afscherming van de plaat in gelijke grootte pie-vormige wiggen.
3. Incubeer de cellen bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
4. Verwijder cellen van de incubator en patch cellen van een kolonie op een frisse YEPD plaat. Twee patches van twee verschillende kolonies moet worden gegenereerd voor elke stam. Op dit moment moeten de stammen te analyseren worden gecodeerd om ervoor te zorgen de replicatieve levensduur experiment wordt uitgevoerd "blind", waarbij de dissectors niet weet wat de identiteit van de afzonderlijke stammen.
5. Incubeer de gepatchte, gecodeerd cellen bij 30 ° C tot de volgende avond.
6. Verwijder de cellen en licht patch cellen van elkaar gecodeerd stam in de frisse YEPD platen, die zal dienen als de experimentele platen gebruikt voor de replicatieve levensduur analyse. De cellen moeten worden opgelapt langs een verticale lijn aan de linkerkant van het YEPD plaat (figuur 1). Ongeveer 3-5 plekken per plaat is optimaal, in de veronderstelling replicatieve levensduur analyse van 20 cellen van elke patch. Het is niet nodig (noch wenselijk) om een ​​groot aantal cellen over te dragen aan de frisse YEPD plaat, want dit zal ertoe leiden dat de cellen om dik groeien tijdens de incubatie gedurende de nacht, die hun latere replicatieve levensduur kan beperken.
7. Incubeer de vers gepatchte plaatjes gedurende een nacht op de bank top.

Deel 2: Positie-cellen voor replicatieve levensduur analyse.

In deze paragraaf beschrijven we hoe de gistcellen op de plaat en hoe maagdelijke dochter van cellen voor replicatieve levensduur analyse kan worden bereikt positie. Vanaf dit punt, moeten alle borden worden parafilmed, behalve wanneer ondergaan dissectie, om uitdroging te voorkomen.

1. Met behulp van een microscoop is uitgerust met een microdissectie apparaat geschikt is voor gist, transfer ongeveer 50 cellen van de eerste gepatcht stam naar een positie op de plaat distaal van de gepatchte cellen. Als uw microscoop fase wordt gesorteerd, kunnen deze gradaties worden gebruikt om ervoor te zorgen de cellen zullen worden makkelijk te vinden bij volgende iteraties. Op de Zeiss Axioscope 40, kunnen cellen van de eerste gepatcht stam worden geplaatst op de coördinaten 90 x 10 en verticaal opgestelde vanaf daar.
2. Reinig de naald van de cellen door herhaaldelijk aanraken van het agar oppervlak, maak dan een gat in de agar door het forceren van de naald door de agar oppervlak. Dit gat zal dienen als een marker te oriënteren je op het bord bij volgende iteraties van dissectie en dochter cel verwijderen. Zorg dat er geen gistcellen krijgen in het gat, of ze zal groeien en vormen een kolonie.
3. Direct boven het gat, verticaal uit te lijnen individuele gistcellen in 20 gelijkmatig verdeeld posities, met 1-3 naald diameters (~ 100 uM) tussen elke cel positie (figuur 1). Om de paar cellen, plaats twee cellen naast elkaar in dezelfde positie in de regel in plaats van een. Dit zorgt voor redundantie tijdens de maagdelijke dochter celselectie, als een van de overgedragen cellen niet verdelen.
4. Tussen de 10 ^e en 11 ^e positie in de lijn, ontstaan ​​van een horizontale reeks van 7-8 gaten in de agar. Dit zal dienen als een marker te oriënteren je op het bord bij volgende iteraties van dissectie en dochter cel verwijderen. Zorg dat er geen gistcellen krijgen in de gaten, of ze zal groeien en vormen een kolonie.
5. Herhaal stap 2,1-2,4 voor elke patch op de plaat, blijven reeks cellen verticaal langs dezelfde as. Voor stap 2.2, moet het aantal gecreëerde gaten komen overeen met de patch nummer (een gat voor de eerste patch, twee gaten voor de tweede, etc.).
6. Zodra cellen zijn bekleed voor elke patch, parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende ongeveer 2 uur.
7. Herhaal stap 2.1-2.6 voor elke plaat in het experiment.

Deel 3: Zorg voor maagdelijke dochter cellen voor de levensduur analyse

In deze paragraaf initiëren we de levensduur analyse door ervoor te zorgen dat elke cel begint als een maagdelijke dochtercel.

1. Verwijder de platen uit de couveuse en controleer dat de meeste gekleed cellen hebben een celdeling ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling in te vullen, gaat u terug de plaat naar de incubator.
2. Beginnen met de eerste gekleed cel, gebruik de naald dochter cellen van de moeder cel losmaken door voorzichtig het plaatsen van de naald op de top van de bijgevoegde cellen. Het is soms handig aan de zijkant van de microscoop basis kraan, terwijl de naald rust op de cellen.
3. Plaats de vrijstaande dochter cel in de verticale lijn, ter vervanging van de moeder cel en eventuele bijkomende dochter cellen en ze te verplaatsen tijdelijk opzij.
4. Herhaal stap 3.2 en 3.3 voor elk van de array cellen. Als een cel niet verdelen, neem een ​​dochter cel van een van de redundante cellen gepositioneerd in stap 2.3. Wanneer u klaar bent, moet je 20 dochter van cellen voor elke patch verticaal uitgelijnd op de levensduur plaat.
5. Verzamel alle van de moeder cellen en extra dochter cellen in een stapel en weer terug over te brengen naar een gebied in de buurt van de patches ("het kerkhof"). Het is belangrijk om ongewenste cellen te houden ver van de cellen die levensduur analyse tot de vorming van microkolonies en de uitputting van de lokale voedingsstoffen te voorkomen.
6. Parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende ongeveer 2 uur.
7. Herhaal stap 3.2-3.6 voor elke plaat in het experiment.

Deel 4: Het meten van de replicatieve capaciteit van de individuele cellen

1. Bereid de levensduur data sheets. Een levensduur data sheet kan een eenvoudige raster waarbij elke rij correspondeert met een individuele moeder cel en elke kolom komt overeen met een leeftijd-punt (figuur 2). Label elke data sheet op basis van het aantal stammen te analyseren.
2. Verwijder de platen uit de couveuse en controleer dat de meeste gekleed cellen hebben ten minste een celdeling ondergaan. Als er extra tijd nodig is om de celdeling in te vullen, gaat u terug de plaat naar de incubator.
3. Beginnen met de eerste geschaard cel op de eerste plaat, visueel waarnemen van de moeder en dochter cel (len) en bepalen van het aantal celdelingen die zich hebben voorgedaan. Het is over het algemeen makkelijk om te bepalen hoeveel dochter-cellen een moeder heeft, op basis van karakteristieke patronen van cel regelingen. Noteer het nummer van de dochter van cellen die door de moeder cel in het juiste vakje op de levensduur scoreblad.
4. Gebruik de naald dochter cellen los te maken van de moeder cel zoals beschreven in stap 3.2.
5. Behoud van de moeder cel in haar positie in de verticale lijn en zet de dochter cel (len) om tijdelijk opzij.
6. Herhaal stap 4.3-4.5 voor elk van de array cellen.
7. Verzamel alle van de afgedankte dochter cellen en verplaats ze naar het 'kerkhof', gelegen in de buurt van de oorspronkelijke patches.
8. Parafilm de plaat en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 uur.
9. Herhaal stap 4,3-4,8 voor elke plaat in het experiment.
10. Herhaal de stappen totdat alle 4,2-4,9 moeder cellen zijn gestopt te delen. Als de moeder cellen leeftijd, de voortgang van de celcyclus wordt langzamer en zal het wenselijk zijn om de plaat voor langere tijd tussen leeftijd-punten broeden. Platen kunnen worden geplaatst bij 4 ° C gedurende de nacht.

Deel 5: Vertegenwoordiger resultaten.

De ruwe gegevens die door een replicatie levensduur experiment is een lijst met nummers die overeenkomen met dochter cellen die door elke moeder cel op elke leeftijd-punt (figuur 2). Door optelling van elke rij van het scoreformulier, is de replicatieve levensduur voor elke moeder cel verkregen. Gegevens voor moeder cellen van dezelfde experimentele groep kan worden samengevoegd tot een survival curve (figuur 3A) te genereren en om statistische berekeningen, zoals de gemiddelde levensduur, de mediaan levensduur, en de standaarddeviatie uit te voeren. Een niet-parametrische test, zoals de Wilcoxon Rank-Sum test kan worden uitgevoerd om te bepalen of er significante verschillen in levensduur werden ontdekt tussen de experimentele groepen. Wanneer het experiment correct werkt, moet het voortbestaan ​​curve worden ruwweg in overeenstemming met Gompertz-Makeham kinetiek met een sigmoïdale shap met een lage vroege sterfte volgde op een relatief snelle daling van de overleving en een afvlakking van de curve een latere eeuwen. De meeste wild-type stammen hebben replicatieve levensduur waarden in de 20-30 range generatie, hoewel variatie buiten dit bereik is gemeld.

Figuur 1. Diagram van een typische replicatieve levensduur plaat. De avond voor het begin microdissectie van gistcellen, dat 3-5 stammen licht gepatcht op het oppervlak van een YEPD plaat (rode vakjes) in een verticale lijn langs de ene kant van de plaat. Na de groei van 's nachts, zijn ongeveer 30 individuele cellen uit elke stam verticaal gekleed in een regel met 20 posities. Levensduur analysis zullen worden uitgevoerd op v maagdelijke dochter cellen verkregen uit deze eerste cellen. Extra cellen verkregen uit microdissectie tijdens het experiment (bijv. ongewenste dochter cellen) zijn geplaatst in "het kerkhof" (grijze ovaal), dat is ver weg van de experimentele cellen zich in om lokale uitputting van voedingsstoffen als kolonies gevormd worden voorkomen.

Figuur 2. Een replicatieve levensduur tally vel. Ruwe data van een replicatie levensduur experiment wordt getoond. Elke rij komt overeen met een enkele gist moeder cel en elke kolom komt overeen met een leeftijd-punt. Het getal dat in elk vak is het aantal van de dochter van cellen die door die moeder cel op die leeftijd-punt. Elke stam is voorzien van een gecodeerde nummer, dat het individu het ontleden van de gistcellen geen kennis van de identiteit van de stammen wordt geanalyseerd heeft. Twintig cellen zijn getest op elke stam.

Figuur 3. Vertegenwoordiger van de overleving en de groei curves van een replicatie levensduur experiment. (A) Survival curves worden verkregen door het plotten van de fractie van de moeder van cellen nog in leven als een functie van de replicatie leeftijd (aantal celdelingen. (B) groeicurves worden verkregen door het uitzetten van de gemiddelde aantal van de dochter van cellen die door een bepaalde stam als een functie van de leeftijd-punt. In dit voorbeeld, de stam # 2 is een langer leven, maar is langzamer groeit, zoals blijkt uit de verminderde begin van de helling van de groei plot.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose