진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

Summary

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

Abstract

Immunoassays은 더 비싼과 시간이 소요되는 정량 HPLC 또는 GC ^1, 식품 상품에 유해 mycotoxins의 심사 검출을위한 ² 가지 방법에 대한 유효한 대안입니다. 이 프로토콜에서는 플랫폼을 감지으로 immunochemical 체인 ³ 화면 인쇄 전극에 대한 견고한 지원과 같은 자성 구슬의 사용에 따라 연결 immunomagnetic 분석을 조작하고 전기 경쟁력있는 효소를 심문하는 방법을 보여줍니다.

우리의 방법은 HT - 2 T - 2 독소의 총 금액 trichothecenes 가족과 인간의 건강 ⁴ 큰 우려에 속하는 먹은 사람은 미세 독소를 섭취하게 결정하는 것을 목표로하고있다. HT - 2 및 T - 2 향한 100 % 교차 반응과 항체 클론의 사용은 동시에 유사한 민감도 ⁵ 독소를 모두 검색할 수 있습니다.

우리의 분석의 첫 번째 단계는 우리가 자기 구슬의 표면에 HT2 - KLH 공액 독소를 무력화 코팅 단계입니다. 불특정 absorptions을 피하기 위해 필요한 차단 단계 후, 단클론 항체의 추가는 허용 고정화 HT - 2와 샘플 무료 HT - 2 T - 2 현재 또는 표준 용액에 녹아있는 사이의 경쟁.

경쟁 단계의 끝에, 단클론 항체의 양을는 링크된 HT - 2 샘플 솔루션에 독소의 금액에 반비례한다 고정화.

알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP)로 표시 이차 항체는 특정 항체와 고정화 HT - 2 사이의 바인딩을 공개하는 데 사용됩니다. 최종 측정 단계는 화면 인쇄 작업 전극의 표면에 특정 샘플 / 표준 용액에 해당하는, 자기 비드 정지 나누어지는 놓아 수행, 자석 구슬은 아래에 정확하게 위치 자석에 의해 고정하고 집중되고있다 화면 인쇄 전극. 자기 구슬과 AP의 기판 사이에 부화 두 분 후에 효소 제품은 몇 초 간격 이내에 자동으로 팔 측정을 시작하는 것도 가능 휴대용 악기 (PalmSens)를 사용하여 차동 펄스 Voltammetry (DPV)에 의해 감지됩니다.

Protocol

1) 코팅 자성 비즈를 차단 :

로 코팅 자기 구슬을 차단 따라 진행 :

1. 2 ML Eppendorf 튜브 세트를 준비;
2. ; (vortexing하지 떨고 있지만) 믹서 회전 샘플을 사용하여 코팅 자기 구슬을 (코팅 자성 비즈의 준비에 대한 부록 참조) 균질
3. 즉시 균질 후 피펫 각각 별도의 Eppendorf 튜브에 코팅 자기 구슬 10 μl;
4. 설정의 각 Eppendorf 튜브에 솔루션을 차단 무지방 우유의 1ml을 추가;
5. 회전 샘플 믹서에 실온에서 30 분 품어 자기 구슬을합시다;
6. 솔루션 차단 제거 : 2 분 (튜브의 측면 벽에 튀어나와 자기 구슬을 참조)에 넣어 자석 부분 자기 입자 농축기에 튜브를 삽입 이렇게로, 신중하게 구슬은 그대로두고, 뜨는을 피펫;
7. PBS 버퍼 + 난 ₃ + BSA 각 튜브위한 스토리지 솔루션으로 1 ML 추가;
8. 4 코팅 및 차단 자기 구슬을 저장 ° C (코팅 자성 비즈 4 ° C에서 최소 2 개월 안정 것에주의하십시오);

교정 곡선의 건설 및 샘플 분석을위한 자성 비즈 2) 면역 체인

측정 준비가 자기 구슬을 가지고 다음과 같이 진행 :

1. 이 분석가는 각 샘플 추출을위한 코팅 및 차단 솔루션 중 하나 Eppendorf 튜브 (2 ML)를 타고;
2. 각 작업 calibrant 솔루션 추가 Eppendorf 튜브를 타고;
3. 사용하기 전에 회전 샘플 믹서 2 분 자기 구슬을 균질;
4. 자기 입자 농축기를 사용하여 스토리지 액체를 제거;
5. PBS / BSA 세척 솔루션 자석 구슬 세 번 씻으십시오. 액체를 세척 제거;
6. 경쟁 단계 : 준비 추출 시료의 200μl 씻어 자기 비즈를 포함한 각각의 튜브에 대한 추가, 각 시료에 대해 하나 마그네틱 비드 튜브를 사용합니다. 각 표준 용액에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 각각의 자석 구슬 튜브에 단클론 항체 용액 200 μl를 추가합니다. 자석 구슬은 상온에서 회전 샘플 믹서에 반 시간 동안 품어 보자;
7. Eppendorf 튜브에서 경쟁 단계에 사용되는 솔루션을 제거;
8. 단계를 레이블 : 각 마그네틱 비드 Eppendorf 튜브에 표시 이차 항체의 400μl를 추가합니다. 자석 구슬은 상온에서 회전 샘플 믹서에 반 시간 동안 품어 보자;
9. Eppendorf 튜브에서 솔루션을 라벨링 제거;
10. 자석 구슬에게 PBS / 트윈과 함께 세 번 ® 20 세척 솔루션을 씻으십시오. 액체를 제거;
11. DEA 버퍼의 100μl 자석 구슬의 각 나누어지는와 Resuspend. 이제 자기 비즈는 전기 측정 단계에 대한 준비가되어;

멀티플렉서 (MUX) 옵션과 함께 PalmSens 3) 조립

참고 : 기판 가수 분해 효소의 제품은 전극 표면을 파울, 이런 이유로 새로운 전극은 각 측정을 위해 필요합니다.

1. 직렬 케이블을 통해 PalmSens에 PC 노트북에 연결;
2. PalmSens과 CH8 멀티플렉서의 9 - DIN 플러그를 연결합니다.
3. CH8 멀티플렉서가있는 8 채널 MUX 전기 접촉의 직렬 케이블을 연결합니다;
4. 8 자석 블록에 삽입 전극 스트립. 각 작업 전극 아래에 각각의 자석을 배치주의 (참고의, 각 전극에 대해 하나의 자석의 필요 달리 자석 입자가 작업 전극 지역에 집중되지 않습니다 필수적입니다);
5. 여덟 채널 MUX 전기 접촉 전극 스트립에 연결;

DPV 측정에 해당하는 상자에 다음 매개 변수를 사용
E 시작 : 0 (V), E 끝 : 0.6 (V), E 단계 : 0.016 (V); E 펄스 : 0.0339 (V); E 에어컨 : 0 (V), E 증착 : 0 (V), 스캔 속도를 : 0.1 (V / S), T 펄스 : 0.06 (S), T 컨디셔닝 : 0 (S), T 증착 : 0 (S), T의 평균 : 8 (S).

4) 효소 반응과 전기 화학 측정

1. 부드럽게 자기 구슬을 잘 분산된 현탁액을 얻기 위해서는 전기 측정 단계에 대한 준비가 자기 구슬을 포함하는 각 Eppendorf 튜브를 흔들어하여 균질;
2. 바로 균질 후 각 Eppendorf에서 피펫, 해당 작업 전극 표면에 자성 비드 분산의 20 μl의 나누어지는. 한 스트립을 사용 각각의 전극 다른 Eppendorf 튜브 (8 전극 사용 8 개 Eppendorf에 대한 예)에서 촬영한 자기 구슬 20 μl에 대한;
3. 첫 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 2 분 카운트 다운 시작합니다. 14 초 후, 두 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 추가로 14 초 후, 세 번째 전극에 효소 기판 솔루션의 80 μl를 추가합니다. 동시에 INT에서 진행마지막 전극 (14 초 간격과 기판의 각 나누어지는를 드롭 의미)까지 erval (14 초). 14 초의 간격 시간은 측정을 수행할 수있는 potentiostat에 필요한 시간 계산, 노트, 각 센서에 80 μl 솔루션은 작업, 참조 및 카운터 전극을 커버한다. 또한, 각 센서에 대한 솔루션은 인접한 전극의 솔루션을 접촉해서는 안됩니다.
4. 2 분 효소 기판 솔루션의 첫 번째 이외의 카운트 다운 후, 전기 측정을 시작합니다;
5. 각 솔루션에 대한 현재의 봉우리 (μA)를 얻기 위해 PalmSens 라이트 소프트웨어를 사용합니다.

5) 계산

물류 4 매개 변수 방정식을 사용하여 교정 곡선을 수립하고 미지의 샘플을 포함하는 각 Eppendorf 튜브에 대한 밀리리터 당 나노 그램 총 HT-2/T-2 독소 금액의 농도를 계산합니다.

실험 데이터 calibrants의 농도 (NG / ML)에 대한 피크 높이 (μA)는 비선형 안경 매개 변수 물류 (4 - PL) 시그마 플롯 8.0 이상을 사용 방정식의 음모 (1) (사용 장착되어 있어야 Kaleidagraph). 비선형 4 PL 모델은 일반적으로 리간드 바인딩 assays (LBAs) ^6를 설명하기 위해 채택됩니다.

(1)
시그마 플롯 곡선에 맞게 프로그램이 주어진 A, B는, y0는 물류 매개 변수 X0 있습니다.
희석 샘플 추출 솔루션 HT-2/T-2 독소 총 금액의 내용을 계산하는 수식을 사용 explicated
(2)
x는 milliltre 당 nanogram의 물류 사 매개 변수 방정식 (NG / ML)에서 계산된 희석 추출 솔루션에 HT-2/T-2 독소의 총 금액의 질량 농도는
y는 미지의 시료에 대해 얻은 μA의 전류 값이

부록

6) 코팅 자성 비즈

코팅 자기 구슬을 가지고 다음과 같이 진행 :

절차를 워싱

1. tosylactivated Dynabeads을 균질 ® M - 280 (재고 솔루션 2 X 109 구슬 / ML) 1 분 (거품 방지) (자성 구슬의 농도를 유의하시기 바랍니다의 재현성을 보장하기 위해 항상 동일해야합니다에 대한 떨고 (최대 속도) vortexing으로 측정);
2. 즉시 2 ML Eppendorf 튜브에 위의 균질 비즈 1 ML을 피펫;
3. 2 분 (튜브의 측면 벽에 튀어나와 자기 구슬을 참조)에 넣어 자석 부분 자기 입자 농축기에 튜브를 삽입;
4. 조심스럽게 구슬은 그대로두고, 뜨는을 피펫;
5. 자기 입자 농축기에서 Eppendorf 튜브를 제거하고 0.1 M borate 버퍼 산도 9.5 1 ML에있는 구슬을 resuspend. 2 분에 대한 회전 샘플 믹서 2 분 부드럽게 믹스;
6. 뜨는을 피펫;
7. Eppendorf 튜브에 borate 버퍼 솔루션의 피펫 1 ML. 마그네틱 구슬 지금은 코팅 단계에 대한 준비가되어;

코팅 절차

8. 부화 자기 구슬과 HT - 2 - KLH 솔루션, KLH (키홀의 림펫 Hemocyanin) 주식 자석 구슬 1 ML하는 솔루션) (375 MG / ML 최종 HT - 2 - KLH 농도)와 HT - 2 복합 600 ML 추가 20h 37 ° C * 샘플 믹서 회전에 속도 기울기 회전;
9. 부화 장소 뜨는에서 자기 입자 농축기와 피펫의 튜브 후;
   PBS / BSA 버퍼 솔루션 1 ML과 코팅 구슬 두 번 씻으십시오. 각 세척 사이 PBS / BSA 솔루션을 제거합니다. 모든 세척 단계는 5 분 회전 믹서에 자석 구슬과 PBS / BSA 설정을 수행했다;
10. 트리스 / BSA 버퍼 솔루션 1 ML을 사용하여 한 번 자기 구슬을 씻으십시오. 트리스 / BSA 솔루션을 제거합니다. 37 4 H 위해 믹서를 회전에 자성 비즈와 트리스 / BSA 버퍼를 설정하여이 단계를 수행 ° C *;
11. 상쾌 중 1ml를 (4 냉장고에 보관 ° C) PBS / BSA 버퍼 솔루션입니다. 사용하여 한번 자기 구슬 와시 PBS / BSA 솔루션을 제거합니다. 상온에서 5 분을위한 믹서 회전에 자성 비즈와 PBS / BSA 버퍼를 설정하는이 단계를 수행;
12. 단계는 모든 세탁 액체를 제거하고 추가 세척 후 1 ML PBS 버퍼 + 난 ₃ + BSA 저장 액체로;
13. 4 코팅 자기 구슬을 저장 ° C (코팅 자성 비즈 4 적어도 2 개월 안정는 것을 유의하십시오 ° C);

*이 목적 믹서는 전원 공급 장치의 케이블의 삽입을 허용하는 구멍을 갖춘 오븐에 배치됩니다. 또는 믹서는 ° C.는 37 thermostated 방에 배치 수

7) 샘플 준비 및 추출

잘게 지상 샘플 25g (아기 음식이나 아침 시리얼)은 우리 아르믹서 용기에 ighed 및 고속 믹서에서 3 분 acetonitrile / 물 솔루션 (14분의 86) 100 ML로 추출. 5 분 4,000 RPM (3000 G), 뜨는 8 ML이 Mycosep 칼럼로 찍은 및 정화되었다에서 원심 분리 후, 청소 추출 4 ML은 질소 흐름 하에서 건조되었다. 말린 샘플이 몇 개월 -30 ° C에서 최대 저장할 수 있습니다.

8) 샘플 reconstitution

아침 시리얼

Reconstitute PBS 산도 7.4의 40 ML과 말린 아침 시리얼 추출물 (시리얼 기반의 음식이 성인 소비 운명). 이런 방식으로되어 법정 한도 (200 NG / G)와 같은 독소의 농도와 예제는 측정 단계에서 작업 범위의 중간에 떨어지는 신호를 제공합니다.

유아식

PBS 4 ML과 Reconstitute 말린 베이비 푸드 추출물 (시리얼 기반의 식품 유아 소비 운명). 이런 방식으로되어 법정 한도 (20-25 NG / G)와 같은 독소의 농도와 예제는 측정 단계에서 작업 범위의 중간에 떨어지는 신호를 제공합니다.

Discussion

biomolecular 인식 프로브로 항체의 사용은 감지 기술을 널리 사용 가능성을 보여줬습니다, 같은 ELISAs 및 MEIAs 같은 immunochemical 검색 방법론은 많은 실험실 ⁷ 가장 많이 사용되는 응용 플랫폼 간의 요즘입니다.

이러한 방식은 지난 몇 년 동안 뛰어난 감도와 특이성, 많은 연구 그룹의 주요 목표를 달성하는 동시에 공연의 개선과 최적화를하고 있습니다.

이 프로토콜에서는 진균 독소 검출을위한 전기 immunosensor를 조작하고 심문하는 방법을 보여주었다. 우리는 단백질 기반의 센서를 개발하는 전기의 사용은 미래에 증가 중요성으로 증명 것이라 생각합니다. 이것은 광학 개 이상의 전기 탐지의 고유 장점 때문입니다. 전기 화학은 interferences 적은 경향이 사실이고 불특정 흡착에 대한 매우 강력한 검증 및 아침 시리얼과 babyfood 같이 복잡한 샘플 매트릭스에 도전 경우에도 잘 수행했다. 또한, 전기는 소형화와 멀티 배열 적응에 더 적합합니다.

자석 nanoparticles와 함께 이러한 접근 방식의 결합도 분석 공연을 개선하고 특히 식품 샘플의 오염 물질 탐지에 적합적일 수있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.