Fate mappatura genetica inducibile (GIFM) segna e cellule brani con fini di controllo spaziale e temporale In vivo E chiarisce come le cellule da un lignaggio genetico specifico contribuire a sviluppare e tessuti adulti. Dimostrato qui ci sono le tecniche richieste per il destino mappa E12.5 embrioni di topo per l'analisi e epifluorescente espianto.
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Articolo metodologico
Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mappe destino sono generate da marcatura e tracciabilità delle cellule in vivo per determinare come progenitori contribuire a strutture specifiche e tipi di cellule nello sviluppo e nel tessuto adulto. Un anticipo di questo concetto è G enetic ho mangiato nducible F M ANALITICI (GIFM), che collega l'espressione genica, il destino della cellula, e dei comportamenti delle cellule in vivo, per creare mappe sorte sulla base di lignaggio genetico.
GIFM sfrutta X-créer linee dove X è un gene o un insieme di elementi normativi gene che conferisce espressione spaziale di una proteina modificata batteriofago, Cre ricombinasi (Creer T). Creer T contiene una versione modificata e strogen r del dominio di legame eceptor che rende Creer T sequestrato nel citoplasma, in assenza del farmaco tamoxifene. Il legame di tamoxifene comunicati Creer T, che trasloca al nucleo e ricombinazione media tra sequenze di DNA affiancato da siti loxP. In GIFM, ricombinazione si verifica in genere tra un loxP affiancato stop cassetta precedente un gene reporter come la GFP.
I topi sono allevati per contenere una regione o di cella tipo specifico Creer e un allele giornalista condizionale. Topi non trattati non avranno marcatura perché la cassetta Stop al reporter impedisce l'ulteriore trascrizione del gene reporter. Gestiamo la tamoxifene mediante sonda gastrica per tempo le femmine gravide, che fornisce il controllo temporale di rilascio Creer T e traslocazione successive al nucleo di rimuovere la cassetta di arresto del giornalista. A seguito di ricombinazione, l'allele giornalista è costitutivamente e heritably espresso. Questa serie di eventi segni cellule in modo tale che la loro storia genetica è indelebilmente registrato. Il reporter ricombinati serve così come tracciante alto lignaggio genetico fedeltà che, una volta acceso, è disaccoppiato dal genica inizialmente usato per guidare T Creer.
Noi applichiamo GIFM nel topo per studiare lo sviluppo normale e verificare il contributo dei lignaggi genetici per tipi di cellule adulte e tessuti. Usiamo anche GIFM per seguire le cellule mutanti in background genetico per capire meglio fenotipi complessi che imitano le caratteristiche salienti di malattie genetiche umane.
In questo articolo il video guide ricercatori attraverso metodi sperimentali per applicare con successo GIFM. Dimostriamo il metodo con il nostro ben caratterizzati Wnt1-créer T; topi mGFP con la somministrazione di tamoxifen al giorno embrionale (E) 8,5 tramite sonda gastrica seguita da dissezione a E12.5 e analisi da stereomicroscopia epifluorescenza. Abbiamo anche dimostrare come micro-sezionare domini destino mappati per la preparazione espianto o analisi FACS e sezionare adulti destino-mapped cervello per tutto l'imaging montaggio fluorescente. Collettivamente, queste procedure permettono ai ricercatori di affrontare le questioni cruciali in biologia dello sviluppo e modelli di malattia.
Protocollo
Tamoxifene Preparazione e orale procedura Gavage (E8.5)
- Preparare un 20 mg / ml soluzione madre di tamoxifene sciogliendo tamoxifen in fase di pre-riscaldato l'olio di mais.
- Incubare la soluzione a 37 ° C per 2 ore in un vortice nutator e intermittente.
- Proteggere lo stock tamoxifene dalla luce, conservare a 4 ° C, e l'uso per un massimo di un mese.
- Per gli esperimenti di mappatura destino, stabilire una coppia di riproduttori costituito da un Webster svizzero femminile (tipo selvatico; acquistati da Taconic) e un maschio che trasportano sia un gene specifico Creer allele T e un allele giornalista.....
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Discussione
Il sistema GIFM che abbiamo dimostrato può essere utilizzato per rispondere a una vasta gamma di domande in una varietà di processi cellulari. Per esempio, i topi ingegnerizzati con diversi piloti Cre può essere usata per bersagliare qualsiasi tipo di cellula, tessuto o lignaggio genetico di interesse. Inoltre, poiché tamoxifene può essere somministrato in qualsiasi punto temporale embrionale o post-natale, la ricombinazione possono essere indirizzati ad una delle fasi importanti dello sviluppo. Il controllo spaziale e .......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori hanno ugualmente contribuito a questo lavoro e sono elencati in ordine alfabetico. Il contributo di ciascun individuo è evidente dalla sua partecipazione in questo articolo video.
Ringraziamenti
Siamo grati a S. Arber per i topi mGFP e ai membri del laboratorio Zervas che criticamente leggere il giornale e ha fornito assistenza tecnica. A. Brown è stato sostenuto da un premio cervello Estate Science Research Kaplan Graduate. E. Normand è stato sostenuto da un premio Scienza Brain Research Graduate Program. Questa ricerca è stata finanziata con fondi di ricerca di avvio (MZ).
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Riferimenti
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L.
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Ristampe e permessi
