Descriviamo un metodo per l'analisi dell'alterazione di N-glicani legati attraverso la vita inizi di glicoproteine dopo la loro biosintesi in cellule di mammifero. Ciò si ottiene pulse-chase analisi di metabolicamente glicani etichettati, rilascio enzimatico da glicoproteine e l'esame mediante HPLC.
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Articolo metodologico
Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine in cellule di mammifero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fissaggio del Glc
Protocollo
Il seguente protocollo è stato progettato per l'analisi delle catene di zuccheri di glicoproteine totale o di una glicoproteina di interesse specifico. La procedura è sostanzialmente la stessa per entrambi i casi con alcune modifiche come affermato in tutto il protocollo.
- Per l'etichettatura metabolico di N-glicani legati uno ha bisogno di usare una cultura subconfluent di cellule di mammifero coltivate durante la notte in un piatto da 90 mm per ogni campione (i campioni possono rappresentare diversi momenti o trattamenti). Questo protocollo è ottimizzato per le cellule NIH 3T3.
- Affamare le cellule di glucosio da parte incubazione in 5 ml di ....
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Discussione
L'impulso-chase analisi dei glicani in cellule vive con la separazione HPLC fornisce un metodo per studiare la dinamica di oligosaccaridi alterazioni strutturali per tutta la vita di una glicoproteina. È sempre più evidente che tali alterazioni sono coinvolte nella produzione dei segnali per la piegatura ER, controllo qualità e il traffico di 2-5 sistemi. Il metodo può essere applicato non solo per una glicoproteina di interesse specifico, ma anche per analizzare le dinamiche della struttura di glicoprote.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo Zehavit Frenkel e Sandra Tolchinsky per l'assistenza tecnica. Ricerca nel settore di questo lavoro è supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation (1229-1207) e il tedesco-israeliano di cooperazione del progetto (DIP-DFG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Controller del sistema di erogazione multisolvente 600E | Waters | WAT062710 | |
| Acetonitrile LiChrosolv (grado cromatografico per cromatografia liquida in gradiente) | Merck && Co., Inc. | 1.0003 | |
| Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K o Centricon ultracel YM-30 | EMD Millipore | UFC503024 o 4208 | |
| Concentratore 5301, compreso di rotore fisso angolare da 48 x 1,5 / 2,0 ml | Eppendorf | 5301 000.016 | |
| F dializzato–tal Calf Serum | Biological Industries | 04-011-1A | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | GIBCO, di Life Technologies | 41965039 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - privo di glucosio | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Dulbecco’s Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| sale di sodio e di etilendiamminotetracetico (Titriplex III) | Merck & Co., Inc. | 1084180250 | |
| Endo Hf Kit (1.000.000 unità/ml) | New England Biolabs | p0703S | |
| F–siero fetale di vitello (FCS) | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Frac-100 raccoglitore frazioni | Amersham | 18-1000-77 | |
| Sistemi di conteggio con scintillazione liquida LS 6500 | Beckman Coulter Inc. | 510720 | |
| Mannosio, D-[2-3H(N)]- (Attività specifica: 15-30 Ci/mmol) | PerkinElmer, Inc. | NET570A | |
| N-carbobenzossi-leucil-leucil-leucinale (MG-132) | Calbiochem | 474790 | |
| N-glicosidasi F (1000 unità/ml) | Gruppo Roche | 11365177 | |
| N-octylglucoside | Sigma-Aldrich | O3757 | |
| Cellule NIH 3T3 | Collezione americana di colture cellulari | CRL-1658 | |
| Opti-Flour | PerkinElmer, Inc. | 6013199 | |
| Soluzione di acido fosforico (49-51%, per HPLC) | Fluka | 79607 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Beads di proteina A-Sepharose | Repligen | IPA300 | |
| Anticorpo policlonale anti-terminale carbossilico di H2 da coniglio 6 | |||
| Deossicolato di sodio | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Sodio dodecilsolfato | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Fosfato di sodio | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Soluzione di piruvato di sodio (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Colonna Spherisorb NH2, 5 μm, 4,6 x 250 mm | Waters | PSS831115 | |
| Triton X-100 | VWR | 306324N | |
| Processori ad ultrasuoni Vibra-Cell VCX 750 | Sonics and Materials, Inc. | 690-003 | |
| Buffer A: 1% Triton X-100, 0,5% p/v deossicolato di sodio, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS | |||
| Buffer B: 0,5% p/v SDS, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS | |||
| Buffer C: Buffer per reazione di N-glicosidasi F: 200 mM Na3PO4, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5% N-octilglucoside | |||
| NIH 3T3 che esprimono stabilmente H2a 6 | |||
| Buffer D: 0,5% Triton X-100, 0,25% p/v deossicolato di sodio, 0,5% p/v SDS, cocktail inibitore delle proteasi 2% v/v in PBS | |||
| Buffer E: 0,5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–etanolo, cocktail di inibitori della proteasi 2% v/v in PBS | |||
| 2-mercapto–etanolo | Sigma-Aldrich | M3148 |
Riferimenti
- Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z.
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Ristampe e permessi
