MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

Sommario

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

Abstract

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser Spettrometria di Massa desorbimento ionizzazione (MALDI-MS) ^{1, 2.} L'ultra-sottile strato metodo comporta la produzione di un substrato di cristalli di matrice (alfa-ciano-4-acido idrossicinnamici) sulla piastra del campione, che serve come terreno per la semina successiva cristallizzazione di una matrice / analita miscela. I vantaggi del metodo ultra-sottile strato rispetto ad altri approcci deposizione del campione (ad esempio delle gocce essiccate) sono che offre (i) maggiore tolleranza alle impurità come i sali e detergenti, (ii) la migliore risoluzione, e (iii) maggiore uniformità spaziale. Questo metodo è particolarmente utile per la determinazione della massa accurata delle proteine. Il protocollo è stato inizialmente sviluppato ed ottimizzato per l'analisi delle proteine ​​di membrana e utilizzato per analizzare con successo i canali ionici, trasportatori metabolita, e recettori, contenente tra 2 e 12 domini transmembrana ^2. Dopo la pubblicazione originale, ma ha anche dimostrato di essere ugualmente utile per l'analisi di proteine ​​solubili. Anzi, lo abbiamo usato per un gran numero di proteine ​​che hanno una vasta gamma di proprietà, compresi quelli con peso molecolare alto come 380 kDa ^3. Oggi è il nostro metodo di scelta per l'analisi molecolare di massa di tutte le proteine. La procedura descritta produce costantemente spettri di alta qualità, ed è sensibile, robusto e facile da implementare.

Protocollo

E 'molto importante indossare guanti privi di polvere durante la preparazione dello strato sottile.

Pulizia della piastra del campione

1. Utilizzare un acciaio inossidabile placcata in oro o campione MALDI.
2. Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe. Non strofinare o strofinare la superficie con il Kimwipe, per evitare di graffiare la superficie.
3. Lavare con H ₂ O e strofinare delicatamente con un Kimwipe.
4. Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe.
5. Se necessario, ripetere MeOH / H ₂ O / MeOH ciclo di pulizia, sempre che termina con MeOH.

Materiali