Protocollo lifespan per Drosophila melanogaster:generare curve di sopravvivenza per identificare le differenze nella longevità della mosca

Overview

Gli scienziati usano il protocollo Drosophila lifespan per misurare come le diverse condizioni sperimentali influenzano la longevità delle mosche e generano curve di sopravvivenza nel processo per quantificare i risultati sperimentali. Il protocollo del campione presenta il saggio applicato per studiare gli effetti sulla longevità derivanti dall'esposizione a concentrazioni variabili di sostanze chimiche interferenti endocrine, o EDC, come il 17-α-etilestradiolo (EE2).

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster,J. Vis. Exp. 

1. Preparazione degli alimenti

1. Per il mantenimento dello stock e per la crescita larvale, utilizzare un mezzo di farina di mais contenente il 3% di lievito in polvere, il 10% di saccarosio, il 9% di farina di mais precotta, lo 0,4% di agar, in seguito chiamato cornmeal medium (CM).
   1. Mettere 30 g di lievito in 100 mL di acqua del rubinetto, portarlo a ebollizione e lasciarlo bollire per 15 minuti.
   2. Separatamente, mescolare bene 90 g di farina di mais precotta, 100 g di zucchero e 4 g di agar in 900 mL di acqua del rubinetto.
   3. Portare la soluzione a ebollizione, abbassare il fuoco e cuocere per 5 minuti mescolando continuamente.
   4. Dopo 5 minuti, aggiungere la soluzione di lievito caldo e cuocere a fuoco lento per altri 15 minuti.
   5. Spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la soluzione a circa 60 °C.
   6. Aggiungere 5 mL/L di metile 4-idrossibenzoato al 10% in etanolo, mescolare accuratamente e lasciarlo riposare per 10 minuti.
      NOTA: Fai attenzione alla quantità di metile 4-idrossibenzoato, dato che un'alta concentrazione di fungicida potrebbe essere letale per le larve.
   7. Distribuire il mezzo in flaconcini/bottiglie: 8 ml in ogni fiala a mosca (25 mm x 95 mm), 3 ml in ogni fiala a mosca (22 mm x 63 mm) e 60 mL in ogni bottiglia di mosca (250 mL).
   8. Coprire le fiale con tela da formaggio e lasciare asciugare a temperatura ambiente (RT) per 24 ore prima della conservazione.
   9. Calibrare sperimentalmente la giusta consistenza e idratazione del CM modificando la quantità di agar utilizzato e/o i tempi di raffreddamento/asciugatura.
      NOTA: le fiale scollegate, in scatola e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 °C.
2. Per gli adulti Drosophila, utilizzare un mezzo contenente il 10% di lievito in polvere, il 10% di saccarosio, il 2% di agar, in seguito chiamato mezzo adulto (AM).
   1. Mescolare 10 g di lievito in polvere, 10 g di saccarosio, 2 g di agar in 100 mL di acqua distillata.
   2. Portare questa miscela a ebollizione due volte, con un intervallo di 3 minuti, o fino a quando l'agar non viene sciolto, usando un forno a microonde.
   3. Una volta che la soluzione si raffredda a 60 °C, aggiungere 5 mL/L di metile 4-idrossibenzoato al 10% in etanolo, mescolare accuratamente e erogare in flaconcini (10 mL per flaconcino).
   4. Coprire le fiale con tela da formaggio e lasciarle asciugare a RT per 24 ore prima della conservazione.
      NOTA: le fiale scollegate, in scatola e avvolte sono stabili per circa 15 giorni a 4 °C.

2. Drosophila EDC Dosing

1. Preparare una soluzione stock appropriata sciogliendo l'EDC selezionato nel solvente adatto. Per l'EE2 (peso molecolare 296.403), sciogliere 1,48 g in 10 mL di etanolo al 100% per fare una soluzione stock di 0,5 M e conservare a -80 °C.
   ATTENZIONE: Gli EDC sono considerati inquinanti ambientali e devono essere prese precauzioni per gestirli.
2. Diluire la soluzione stock EE2 in etanolo al 10% in acqua (v/v) al fine di ottenere una soluzione da 100 mM. Effettuare le diluizioni successivi (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) negli alimenti CM, a partire dalla concentrazione più bassa e utilizzando la stessa concentrazione finale di solvente per ciascun gruppo di trattamento. Per i flaconcini di controllo utilizzare lo stesso volume del solvente da solo.
   NOTA: si raccomanda di mantenere la concentrazione finale del solvente il più bassa possibile, tenendo presente che la concentrazione finale di etanolo non deve superare il 2% negli alimenti a mosca.
3. Aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato al cibo a base di farina di mais prima della solidificazione, mescolare accuratamente con un robot da cucina, erogare 10 mL in fiale, coprire con garza di cotone e lasciare asciugare a RT per 16 ore prima dell'uso.
   NOTA: utilizzare questo mezzo immediatamente dopo la sua preparazione.
4. Per l'allevamento adulto, preparare diverse soluzioni EE2 funzionanti (rispettivamente 10 mM, 50 mM e 100 mM) in etanolo al 10% in acqua (v/v) e strato 100 μL di ciascuna sulla superficie dell'AM, al fine di ottenere la concentrazione desiderata dell'EE2 (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM). Per il controllo utilizzare lo stesso volume del solvente da solo.
   NOTA: in alternativa, aggiungere la soluzione contenente la giusta diluizione dell'EDC selezionato a una piccola quantità di AM in un tubo conico da 50 mL, vortice accuratamente e stratificarne 1 ml sulla superficie delle fiale AM.
   1. Coprire flaconcini con garza di cotone, consentire l'asciugatura a RT per 12-16 ore sotto delicata agitazione e utilizzarli immediatamente.
      NOTA: il processo di essiccazione deve essere regolato sperimentalmente perché dipende dall'umidità ambiente.

3. Mosche di allevamento

1. Utilizzare un robusto ceppo isogenico, come Oregon R, mantenuto da diverse generazioni in laboratorio.
2. Tenere le mosche in un'incubatrice umidificata e a temperatura controllata, con una luce naturale di 12 ore: fotoperiodo scuro di 12 ore a 25 °C in fiale contenenti cibo CM.
3. In ogni saggio, utilizzare fiale a RT.

4. Protocollo lifespan

1. Impostare 20 fiale di mosche con 8 femmine e 4 maschi e ospitare a 25 °C in CM (10 mL ciascuna).
2. Dopo 4 giorni scartare le mosche e riposizionare le fiale nell'incubatrice.
   NOTA: queste mosche possono essere utilizzate per ricominciare per ottenere altre coorti sincronizzate con l'età delle mosche.
3. Nel tardo pomeriggio del giorno 9, rimuovere tutte le mosche appena chiudite dalle fiale e restituire le fiale all'incubatrice.
   NOTA: alcuni adulti dovrebbero iniziare a chiudere già il nono giorno; scartare queste mosche permette di raccogliere un numero massimo di mosche sincronizzate, evitando la selezione disattenta dei primi emergenti.
4. 16-24 ore dopo, trasferire le mosche adulte (1 giorno) di entrambi i sessi in quattro gruppi di bottiglie da 250 ml contenenti alimenti AM integrati con tre diverse concentrazioni di EDC e uno con il solo solvente. Se necessario, raccogliere un altro lotto il giorno successivo.
5. Mantenere le mosche a 25 °C per 2-3 giorni per consentire loro di accoppiarsi.
   NOTA: il giorno del trasferimento alle fiale alimentari AM corrisponde al primo giorno di età adulta.
6. Dopo due-tre giorni, ordina ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi sotto leggera anestesia di CO_2. Suddividi casualmente ogni sesso in cinque fiale per trattamento ad una densità di 20 individui per flaconcino, fino a quando non ci sono tre repliche di 5 fiale parallele per ogni genere per ogni trattamento.
   NOTA: Lavorare con piccoli gruppi di mosche al fine di prevenire possibili problemi di salute di lunga durata a causa del lungo tempo di esposizione a CO₂.
7. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute al trasferimento precedente, in modo da ottenere automaticamente il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento.
8. Il trasferimento vola in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente ogni 3 giorni contemporaneamente e controlla la morte.
   NOTA: il trasferimento deve avvenire senza anestesia che potrebbe avere un effetto negativo a lungo termine sulla longevità della mosca.
   1. Ad ogni trasferimento, registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte.
      NOTA: il numero di mosche sopravvissute viene calcolato automaticamente nel foglio di calcolo, ma si consiglia di controllarlo visivamente. Le mosche che scappano o muoiono accidentalmente durante il trasferimento non devono essere prese in considerazione. Fai attenzione a non contare due mosche morte trasportate al nuovo flaconcino che riporta questa nota nel foglio di calcolo.
   2. Ripetere i passaggi 4.8 e 4.8.1 fino a quando tutte le mosche muoiono.
9. Per ogni gruppo di trattamento, creare una curva di sopravvivenza come mostrato nella figura 1, al fine di mostrare la probabilità di sopravvivenza di una mosca in un determinato momento.
10. Esegui tre esperimenti indipendenti per ogni gruppo di trattamento delle mosche, utilizzando 100 mosche appena echiuse per ogni esperimento.
11. Preparare una tabella in cui segnalare la durata media della vita (giorni di sopravvivenza media di tutte le mosche per ogni gruppo), la metà del tempo di morte (periodo di tempo in giorni necessari per raggiungere il 50% di mortalità) e la durata massima della vita (quantità massima di giorni necessari per raggiungere il 90% di mortalità).
12. Calcolare le differenze percentuali tra ciascun gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo.
13. Eseguire analisi statistiche per confrontare i diversi gruppi di trattamento.

Representative Results

Figura 1: Curve di durata della vita. A sinistra, viene riportata una tabella rappresentativa in cui il numero di mosche morte è stato registrato ogni 3 giorni, sia per il gruppo di trattamento (medio + EDC [0,05 mM EE2]) che per il gruppo di controllo (medio + solvente), durante l'intero periodo sperimentale. La durata media di ciascun gruppo è stata calcolata utilizzando MATRIX SUM. PRODOTTO; il gruppo trattato ha accorciato la durata media rispetto al gruppo di controllo. A destra, viene mostrata una tipica curva di sopravvivenza delle mosche maschili alimentate con mezzo contenente EE2 (0,05 mM) o solo etanolo per il controllo. La curva di superstiti è diminuita più rapidamente per le mosche trattate che per il gruppo di controllo, con un punto di caduta di svolta precedente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Cornmeal	CA' BIANCA
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Ethanol	FLUKA	2860
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor