Injektion von adulten Drosophila Fliegen: Eine Methode der Verbindung oder Etikettenlieferung

Overview

Dieses Video beschreibt, wie man eine Injektion von lebenden erwachsenen Fliegen durchführt und enthält ein Beispielprotokoll, in dem beschriftete Partikel und Trypanblau in Fliegenabdomen injiziert werden, um Phagozytose zu assay.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Nazario-Toole und Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Vorbereiten von Fluorescein-Partikeln für die Injektion

1. Rekonstituieren Sie 10 mg kommerziell erhältliche, wärmeabgetötete Bakterienpartikel, die mit Fluorescein (siehe Materialtabelle)gekennzeichnet sind, auf eine Lagerkonzentration von 10 mg/ml, indem 990 l sterile 1x PBS und 10 l 50 mM Natriumazid hinzugefügt werden. Wirbel zu mischen.
   1. Teilen Sie in Einweg-Aliquots mit 8 L in 0,2 ml-Rohren auf und lagern Sie sie in einer dunklen Box bei 4 °C, um die Lichtempfindlichkeit zu minimieren.
      HINWEIS: Natriumazid-Konservierungsmittel ist optional und kann weggelassen werden, wenn 10 mg/ml-Bestände mit 1 ml sterilem 1x PBS hergestellt, aliquoted und bei -20 °C gelagert werden.
2. Machen Sie eine 10 ml Lösung von 5% Lebensmittelfärbung in 1x PBS durch Mischen von 500 l Spritze gefiltert grüne Lebensmittelfärbung und 9,5 ml sterile 1x PBS.
3. Waschen Sie Partikel vor der Injektion, um Natriumazid zu entfernen. Mischen Sie 42 l sterile 1x PBS und 8 l von 10 mg/ml in einem 1,7 ml-Rohr. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 2,5 min bei Raumtemperatur.
   1. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 50 l 1x PBS hinzu und Zentrifugen mit maximaler Geschwindigkeit für 2,5 min bei Raumtemperatur.
   2. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.3.1 2x, für insgesamt 3 Wähbe.
   3. Nach der letzten Wäsche den Überstand entsorgen und Partikel in 50 l mit 5% Lebensmittelfärbung in 1x PBS auf 1,6 mg/ml wieder aufhängen.
   4. Wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie, um vor Licht zu schützen. Bei 4 °C lagern, nach 1 Woche entsorgen.

2. Bereiten Sie die Injektionsstation und

1. Bereiten Sie das Injektionspad vor. Um bis zu 4 Genotypen von Fliegen gleichzeitig zu injizieren, verwenden Sie Laborband, um ein rechteckiges_{CO2-Fliegenpad} in 4 Abschnitte zu unterteilen. Auf der Bank in der Nähe des Mikroskops, legen Sie Bereiche, um die Fläschchen zu platzieren, sobald Fliegen auf dem Pad aufgereiht wurden (eine für jede Ecke des Pads).
2. Bereiten Sie Fläschchen von altersgerechten, 4-7 Tage alten Fliegen zur Injektion vor. Für jede zu prüfende Sorte 5 Männchen und 5 Weibchen in eine frische, gekennzeichnete Durchstechflasche mit vorbereiteten Fliegenfuttern geben und bei 25 °C aufbewahren.
3. Bereiten Sie den pneumatischen Injektor (siehe Tabelle der Materialien) vor, indem Sie das Gerät auf 100 ms (kurze Gasdrucke zur Ausstoßung der Flüssigkeit – die die Lieferung von Sub-Nanoliter-Volumen ermöglicht) TIMED-Modus einstellen.
4. Bereiten Sie die Mikroskop-Dias vor. 1,5-Zoll-Streifen aus elektrischem Klebeband schneiden, mit der Klebeseite in eine Schlaufe falten und auf ein beschriftetes Mikroskopschlitten legen.

3. Bereiten Sie Glas Kapillarnadeln

1. Ziehen Sie Glasnadeln (dünne Wandglaskapillaren) mit einem Nadelzieher.
   1. Halten Sie die Nadel mit einem Mikrometer unter das Mikroskop und brechen Sie die Spitze mit #5 Feinpunkt-Edelstahl-Pinzette. 100 'm-Spitzen reichen aus, um die Nagelhaut der Fliege zu durchbohren und gleichzeitig die Verwundung zu minimieren.
   2. Messen Sie das Flüssigkeitsvolumen, das in jede Fliege injiziert wird. Die Nadel mit steriler 5%-Lebensmittelfärbung in 1x PBS beladen und die Flüssigkeit auf einen Tropfen Mineralöl auf einem 0,01 mm-Stufenmikrometer vertreiben.
      HINWEIS: Wenn das Flüssigtröpfchen kugelförmig ist, wird das Volumen in Pikolitern als (Größe)³/1910 berechnet. Eine Nadel mit einem Durchmesser von 100 m wirft 2 nL in 100 ms aus.

4. Fliegen injizieren

1. Pipette 10 l von 1,6 mg/ml Partikelauf ein kleines Quadrat Parafilm.
   1. Ziehen Sie die Flüssigkeit in die Nadel und montieren Sie in der Injektordüse (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Anästhetisieren Fliegen mit CO₂ und reihen sie in ihrem vorgesehenen Bereich auf dem Flypad, mit der ventralen Seite nach oben und den Köpfen nach vorne des Pads ausgerichtet. Legen Sie Fläschchen in entsprechenden Bereichen auf die Bank.
   3. Injizieren Sie Fliegen an der oberen Ecke des Bauches mit 5, 100 ms Pumpen von Flüssigkeit (ca. 10 nL insgesamt).
   4. Übertragen Sie die injizierten Fliegen auf die entsprechenden Fläschchen, beachten Sie die Zeit auf der Durchstechflasche. Bei 25 °C aufbewahren.
2. Laden Sie eine neue Nadel mit 0.4% Trypan Blue Solution.
3. Stellen Sie den pneumatischen Injektor auf GATEDein, wodurch ein konstanter Luftstrom die Flüssigkeit aus der Nadel drückt.
4. Anästhesisieren Fliegen, nachdem sie für 30 min ausgeruht haben und injizieren mit Trypan Blue, bis der Bauch voll und distended ist.
   HINWEIS: Bei der Untersuchung der Phagosomenreifung mit Partikeln, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff beschriftet sind, lassen Sie fliegen 1 h ruhen und nicht mit Trypanblau injizieren, bevor Sie Fliegen montieren.
5. Mount Fliegen auf Mikroskop-Dias mit elektrischem Klebeband, ventrale Seite nach unten. Drücken Sie die Flügel zur Seite der Fliege und sichern Sie sie am Band. Drücken Sie auch vorsichtig den Kopf in das Band, um sicherzustellen, dass sich die Fliege nicht bewegt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.