Disociación de células individuales de Caenorhabditis elegans: Un método para aislar las células vivas

Overview

Este video describe un método para disociar gusanos enteros en una suspensión de una sola célula adecuada para FACS o inmunoprecipitación de células intactas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Alemania et al, Aislamiento de poblaciones específicas de neuronas de Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparación y recolección de gusanos envejecidos para el aislamiento celular

NOTA: A continuación se explica el aislamiento de las neuronas colinérgicas de la cepa transgénica unc-17::GFP (OH13083) obtenida del repositorio de cepas caenorhabditis Genetics Center (CGC) de la Universidad de Minnesota. Es imperativo mantener condiciones estériles para evitar la contaminación de hongos o bacterias.

1. Prepare y sincronice gusanos a través del método de blanqueamiento descrito por T. Stiernagle. Para experimentos de envejecimiento, placa gusanos en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que contienen 25 μM solución de agua de fluorodeoxiuridina (FuDR) para reducir la producción de huevos y detener la eclosión de huevos. Inspeccione las placas de agar regularmente para evitar la contaminación o la eclosión de huevos, ya que esto causará resultados poco fiables.
   NOTA: Para las células unc-17::GFP, normalmente se utilizan tres placas NGM de 100 mm x 15 mm para aislar una cantidad suficiente de celdas de interés.
2. Recopile gusanos y prepare búferes para el aislamiento celular.
   1. Recoge gusanos en un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos de la placa con 1,5 ml de amortiguador M9 (1 mM MgSO_4,85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) y centrífuga durante 5 minutos a 1.600 x g. Deseche el sobrenadante y lave los gusanos con 1 ml de amortiguador M9. Repita la centrifugación y la lave durante un total de cinco veces para eliminar la mayor cantidad posible de contaminación por E. coli.
      NOTA: Añadir antibióticos (50 μg/ml), como la ampicilina, a este paso puede ayudar a reducir la contaminación bacteriana.
   2. Para dos muestras, prepare 2 ml de tampón de lisis dodecyl sulfato-ditiotiothreitol sódico (SDS-TDT): 200 ml de TDT de 200 mM, SDS del 0,25% (w/v), HEPES de 20 mM (pH 8,0) y 3% (w/v).
   3. Preparar 15 ml de amortiguador de aislamiento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl_2,2 mM MgCl_2,25 mM HEPES [pH 7.3]) y almacenarlo en hielo.
      NOTA: Tanto el búfer de lisis SDS-TDT como el búfer de aislamiento deben ser frescos antes de cada experimento.
3. Interrupción de cutículas y aislamiento de una sola célula
   1. Animales centrífugas recogidos en el paso 1.2.1 durante 5 min a 1.600 x g. Retire todo sobrenadante y suspenda los gusanos en 1 ml de soporte M9 y transfiéralo al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Gusanos de pellets con centrifugación a 1.600 x g durante 5 minutos.
   3. Añadir 200 μL de Tampón de lisis SDS-TDT a gusanos e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Los gusanos deben parecer "guiñados un ojo" a lo largo del cuerpo si se ven bajo un microscopio de luz.
      NOTA: La exposición prolongada al búfer de lisis SDS-TDT puede provocar la muerte de gusanos, que se puede controlar observando gusanos. Los gusanos que están muertos se alargarán y no se rizarán.
   4. Agregue 800 μL de amortiguador de aislamiento helado y mezcle deslizando suavemente el tubo.
   5. Gusanos de pellet durante 1 min a 13.000 x g a 4 °C, retire el sobrenadante y lave con 1 ml de búfer de aislamiento.
   6. Repita el paso 1.3.5 durante un total de cinco veces, eliminando cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez.
   7. Añadir 100 μL de mezcla de proteasa de Streptomyces griseus (15 mg/ml)(Tabla de materiales)disuelto en búfer de aislamiento al pellet e incubar durante 10-15 min en RT.
      NOTA: Al igual que con el tampón de lisis SDS-TDT, la digestión prolongada de proteasa puede resultar en un escote excesivo de proteínas a lo largo de la membrana plasmática, evitando el aislamiento de la GFP expuesta a la superficie a través de cuentas magnéticas.
   8. Durante la incubación con mezcla de proteasa, aplique interrupciones mecánicas canalizando muestras hacia arriba y hacia abajo contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una punta de micropipette de 200 μL para ~60-70 veces. Mantenga la punta de la pipeta contra la pared del tubo de microcentrífuga con presión constante para desasociar correctamente las células.
   9. Para determinar la etapa de digestión, retire un pequeño volumen (~1-5 μL) de la mezcla de digestión, suéltela en una diapositiva de vidrio e instáligala usando un microscopio de cultivo de tejido. Después de 5-7 minutos de incubación, los fragmentos de gusano deben haber reducido visiblemente la cutícula y un purines de células serán fácilmente visibles.
   10. Reacción de parada con 900 μL del medio L-15 de Leibovitz frío disponible comercialmente complementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina (concentración final a 50 penicilinas U/mL y 50 μg/mL estreptomicina).
   11. Fragmentos y células aislados de pellets por centrifugación durante 5 min a 10.000 x g a 4 °C. Lave las células peletadas con 1 ml de soporte frío con suplemento L-15 dos veces más para asegurarse de que se elimine el exceso de residuos y cutícula.
   12. Células peletadas resuspend en 1 ml de soportes complementados con L-15 y dejar en hielo durante 30 min. Lleve la capa superior, aproximadamente 700-800 μL, a un tubo de microcentrífuga. Esta capa contiene celdas sin desechos celulares y se utilizará en el aislamiento posterior de las células de interés.
   13. Siguiendo las instrucciones del fabricante, utilice un contador de células automatizado o hemocítómetro para medir la densidad celular de 10-25 μL de células aisladas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010