Articolo metodologico

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

DOI:

10.3791/2173

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14 dicembre 2010

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1Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Physics Department - James Franck Institute, University of Chicago, 3Interdisciplinary Scientist Training Program, University of Chicago

In questo articolo

Sommario

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In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Abstract

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Il regolamento di adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) è essenziale per la migrazione cellulare e rimodellamento ECM. Adesioni focali sono le assemblee macromolecolari che la coppia di F-contrattili actina del citoscheletro per l'ECM. Questo collegamento consente la trasmissione delle forze meccaniche intracellulare attraverso la membrana cellulare al supporto sottostante. Studi recenti hanno dimostrato le proprietà meccaniche della ECM regolare adesione focale e F-actina morfologia oltre a numerosi processi fisiologici, quali la differenziazione cellulare, la divisione, la proliferazione e la migrazione. Pertanto, l'uso di substrati di coltura cellulare è diventato un metodo sempre più diffuso per controllare con precisione e modulare le proprietà meccaniche ECM.

Per quantificare le forze di trazione in adesioni focali in una cella aderente, supporti compatibili sono utilizzati in combinazione con imaging ad alta risoluzione e tecniche computazionali in un microscopio chiamato metodo della forza di trazione (TFM). Questa tecnica si basa sulla misurazione della magnitudo locale e la direzione del substrato deformazioni indotte dalla contrazione cellulare. In combinazione con alta risoluzione microscopia a fluorescenza di proteine ​​fluorescenti tag, è possibile correlare l'organizzazione del citoscheletro e rimodellamento con le forze di trazione.

Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per la preparazione di due dimensioni, matrici compatibili al fine di creare un substrato di coltura cellulare con un ben caratterizzato, sintonizzabile rigidità meccanica, che è adatto per misurare la contrazione cellulare. Questi protocolli includono la realizzazione di idrogel di poliacrilamide, rivestimento di proteine ​​ECM su gel di tali cellule placcatura in gel, e ad alta risoluzione, microscopia confocale utilizzando una camera di perfusione. Inoltre, mettiamo a disposizione un campione rappresentativo di dati che dimostrino posizione e la grandezza delle forze cellulare utilizzando protocolli citato TFM.

Protocollo

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1. Attivazione della superficie coprioggetto

  1. Coprioggetti (# 1.5, 22x40 mm) vengono puliti con una serie di lavaggi sapone ed etanolo in un protocollo precedentemente descritto (Waterman-Storer, 1998) per pulire e rimuovere la polvere.
  2. Coprioggetto posto in un rack supporto in acciaio inox, in modo tale che coprioggetto sono distanziate tra loro e non toccare.
  3. In cappa (guanti di nitrile e occhiali consigliato), diluire piena forza 3-aminopropyltrimethoxysilane in isopropanolo per una concentrazione finale del 2% (2 ml silano / 100 ml di isopropanolo) per riempire un piatto quadrato di vetro (~ 350 ml di volume). A causa di reattività c....

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Discussione

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La procedura descritta qui per la configurazione di un microscopio a forza di trazione (TFM) sperimentare, insieme con l'implementazione delle routine di tracciamento computazionale (Sabass et al., 2008), consente per la quantificazione delle forze cellulare con micron scala risoluzione spaziale. Per ottimizzare il protocollo sperimentale, è fondamentale per formare un substrato di gel puro ed uniforme con rivestimento uniforme di legante ECM. Discutiamo potenziali insidie ​​di seguito:

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il laboratorio di Ulrich Schwarz per il software di monitoraggio di calcolo utilizzati nella quantificazione delle forze di trazione cellulare (Sabass et al., 2008). Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di carriera Burroughs Wellcome e Pioneer Award NIH direttore (DP10D00354) per ML Gardel e Medical Scientist Premio Nazionale delle Ricerche Servizio (5 T32 GM07281) a SP Winter.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-aminopropiltrimetossilanoAldrich28, 177-8
Acrylamide al 40%Bio-Rad161-0140
Bis-acrylamide al 2%Fisher ScientificBP1404
TEMEDFisher ScientificBP 150-20
Persolfato di ammonioFisher ScientificBP179
Microsfere fluorescenti da 40 nmInvitrogenF8789
Sulfo-SANPAHPierce, Thermo Scientific22589
Camera per imaging confocale (RC-30)Warner Instruments64-0320
Centrifuga per coprioggettiFatta in casaNA
Lampada a ultravioletti CL1000UVP Inc.95-0228-01
Porta campioni in acciaio inossidabileElectron Microscopy Sciences72239-04
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)esanoico)InvitrogenA-20770
Idracina idrataSigma-Aldrich225819
Periodato di sodioThermo Fisher Scientific, Inc.20504
IsopropanoloFisher ScientificA416-4
FibronectinaSigma-AldrichF2006
CollageneBD Biosciences354236
Coprioggetti (#1.5)Corning2940‐224
GlutaraldeideElectron Microscopy Sciences16120
Rain-XSOPUS Productswww.rainx.com
Acido aceticoAcros Organics64-19-7

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  2. Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer

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Preparazione della matrice conformeQuantificazione della contrazione cellulareFabbricazione di idrogel di poliacrilammideRivestimento con proteine della ECMMicroscopia a forza di trazioneImaging in microscopia confocaleAnalisi delle adesioni focaliIncorporazione di sferette fluorescentiRegolazione della rigidit del substratoPreparazione del substrato per colture cellulari

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