セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定

Summary

セプターのセルカウンターは、セルを数えるセルの直径とボリュームを監視し、一つの文化から次の細胞集団の健康と品質を確認するために使用するために使用できる携帯型自動化されたデバイスです。

Abstract

細胞のカウントは、多くの場合、in vitroでの細胞培養のために必要であるが、退屈なステップです。一貫性のある細胞濃度は、実験的な再現性と精度を確保する。細胞数は、その後の実験に、トランスフェクションまたは感染症のために細胞を播種し、セルベースアッセイの準備を、不死化または変形の評価、細胞の健康と増殖率を監視するために重要である。細胞数は、特に細胞応答の定量的測定のために、、正確で一貫性のある、かつ早くなることが重要です。

細胞計数のスピードと正確さのためのこの必要性にもかかわらず、400の研究者の71％は血球計算盤を用いて細胞をカウント^1を調査した。血球計算法は安価ですが、それは面倒で不正確なカウントで、その結果ユーザーのバイアスや誤用、対象となります。 Hemocytometersは、細胞懸濁液は、指定されたボリュームにロードされ、顕微鏡下でカウントされている特殊な光学ガラスで作られています。血球計算法の誤差の源は、次のとおりサンプルの不均一な細胞分布、多すぎたり少なすぎたり、細胞のサンプルで、特定のセルが定義されている計数の領域内に収まるかどうかの主観的な意思決定、血球計数器の汚染、ユーザからユーザへの変化を、および血球計充填率²の変化。

手動の計数に関連付けられて退屈を軽減するために、研究者の29％がデバイスを数える自動化された細胞を用いて細胞を数えるが、これらは視覚ベースのカウンタ、コールター原理を用いて細胞を検出するシステム、またはフローサイトメトリー^1が含まれます。ほとんどの研究者のための、自動化システムを使用する主な障壁は、これらの大規模なベンチトップ測定器¹に関連する価格です。

セプターの細胞計数は、比較的低コストでカウントコールターの自動化と精度を提供する自動化されたハンドヘルドデバイスです。システムは、コールターの検出のためにアナログとデジタルハードウェアの組み合わせを使用して小型化した形式のインピーダンスベースのパーティクルの検出³の原理、信号処理、データストレージ、およびグラフィカル表示を採用しています。使い捨てチップは、セルサイズとサブミクロンおよびサブピコリットルの分解能での細胞容積による差別を可能にする微細加工、細胞感知ゾーンに設計されています。精密液体処理チャンネルと電子機器で拡張された、セプターの細胞計数は、グラフィカルにヒストグラムとして表示される細胞集団の統計を報告します。

Protocol

1。細胞計数の重要性

1. カウント細胞はin vitroでの細胞培養でのために必要ですが面倒なステップです。
2. 一貫性のある細胞濃度は、実験的な再現性と精度を確保する。
3. 細胞数は、その後の実験に、トランスフェクションまたは感染症のために細胞を播種し、セルベースアッセイの準備を、不死化または変形の評価、細胞の健康と増殖率を監視するために重要である。
4. 細胞計数のスピードと正確さの必要性にもかかわらず、、400研究者の71％は血球計算盤を使用して、カウント細胞を調査した。血球計算法は安価ですが、それは面倒で不正確なカウントで、その結果ユーザーのバイアスや誤用、対象となります。
5. 血球計算法の誤差の源は次のとおりサンプルの不均一な細胞分布、多すぎたり少なすぎたり、細胞のサンプルで、特定のセルが定義されている計数の領域内に収まるかどうかの主観的な意思決定、血球計数器の汚染、ユーザからユーザへの変化を、および血球計充填率の変化。
6. 手動の計数に関連付けられて退屈を軽減するために、研究者の29％が自動化された細胞計数装置を用いて細胞を数える。しかし、ほとんどの研究者のために、これらの大型ベンチトップ機器に関連付けられている価格は、それらの使用の障害となります。
7. セプターの細胞計数は、比較的低コストでカウントコールターの自動化と精度を提供する自動化されたハンドヘルドデバイスです。
8. システムは、センシング、信号処理、データストレージ、およびグラフィカルな表示、アナログとデジタルハードウェアの組み合わせを使用して小型化した形式でインピーダンスベースの粒子検出のコールター原理を採用しています。
9. 使い捨てのセンサーは、細胞の大きさとサブミクロンおよびサブピコリットルの分解能での細胞容積による差別を可能にする微細加工、細胞感知ゾーンに設計されています。
10. 精密液体処理チャンネルと電子機器で拡張された、セプターの細胞計数は、グラフィカルにヒストグラムとして細胞集団の統計情報が表示されます。

2。カウントのための単一細胞懸濁液の調製

1. セプターのセルカウンタを使用するには、細胞の単一の細胞懸濁液を希釈することにより開始する、リン酸塩で緩衝生理食塩水。 mL当たり10,000-500,000細胞の濃度が最適です。
2. 1.5mlマイクロチューブに希釈した細胞100μLを移す。

3。セプターを使用して実行するセルのカウント

1. 計器の背面にあるトグルを押し続けると、王笏のセルカウンタをオンにして、表示​​される画面上の指示を待ちます。
2. プロンプトが表示されたら、機器の前面に向かって対向する電極センサーパネルでセプターユニットの端にセンサーを取り付けます。
3. セプターのセンサーは、電子検出ゾーンと統合された細胞検知電極と、精密成形サンプリングチャンバーで構成されています。センサーにより、サブピコリットルの分解能でサブミクロンの解像度でセルサイズを区別し、細胞の体積になります。
4. 一貫性のあるセンサ技術は、同じサンプル量がカウントされると正確なサイズ測定が行われることを保証します。
5. 一度センサーが取り付けられている、次のように画面上の指示に従ってカウント処理の各ステップを実行します。
6. 画面が読み込むときに"開始するためにプランジャーを押しながら、"プランジャーを押し下げる。画面にはその後、"水没センサーを。"と表示されます細胞懸濁液にセンサーとセンサーに細胞懸濁液を吸引するためにプランジャーを離して水没。
7. プランジ​​ャーは、電気信号​​として機能し、センサーにサンプルに加え、デッドボリュームが描画されます。それは、ピペッティングと同様プランジングのスピードや正確さは関係ありません。このプロセスには数秒かかります。準備ができたら、楽器音が鳴ります、および"ロードされたサンプルは、"画面に表示されます。
8. サンプルをセンサーに読み込まれると、それは、マイクロチャネル通過し、細胞のサイズとセルの体積を評価するための感知ゾーンを通って描画されます。サンプル50μLがカウントされるとセンサーがカウントを停止するために楽器を伝えます。
9. カウントが完了した後、測定器の画面は"完全なカウント。センサーを削除し、破棄してください。"と表示されますプロンプトに従い、センサーを取り外して廃棄します。
10. 楽器は、その画面上のセルの大きさや直径のヒストグラムだけでなく、mL当たりの細胞濃度が表示されます。

4。データ解析

1. カウントが完了するとヒストグラムが計器に表示された後、トグルボタンを押してゲートを適用します。 "自動ゲーティング"を選択するかのどちらかを自動的にヒストグラムプロファイルに基づいてゲートを設定する、または前回データからのゲートを使用するために"最後に使用してください"。
2. に関係なく、選択の、ゲートが手動でデータを微調整するために移動することができます。左のゲートを選択してスクロールし、もう一度トグルボタンを押してください必要に応じてゲートを移動するggle。
3. その後、右側のゲートを活性化し、右側のゲートを配置するトグルをスクロールするには、再度トグルを押してください。もう一度クリックすると、新しい細胞の濃度、平均細胞容積と直径が表示されます。
4. トグルは、日付、時間、平均セルサイズ、および細胞の容積を意味する間、表示を切り替えるにはどちらの側に移動することができます。
5. 最大72ヒストグラムに楽器自体に格納することができます。パーソナルコンピュータへデータをアップロードするには、表示画面上にUSBケーブルをポート経由で測定器を取り付けます。
6. PC上で、二重"接続"をクリックしてソフトウェアを起動するにはセプターのソフトウェアアプリケーションをクリックしてください。すべてのカウントは自動的にソフトに移植する。
7. セプターのアプリケーションソフトウェアは、ボリュームまたは直径のいずれかで文化の人口分布を詳細にヒストグラムが表示されます。ダウンロードしたファイルは、生データが指定されたセルの直径またはセルのボリュームのビンに表示されるMicrosoft Excelでは、にエクスポートすることができます。

5。代表的な結果

1. ナインティーンの異なる細胞株をカウントし、理論的な出発濃度に調製したコールターカウンターを用いて決定された。これらの細胞懸濁液は、さらに理論的な細胞の濃度で細胞懸濁液を得るために希釈した。
2. セプターの細胞計数は、細胞濃度を決定するために使用されていました。図1は、理論的な細胞濃度と一緒に5代表的な細胞株について測定された5希釈を示しています。
3. R2の値によって示されるように直線性の高いは、そのセプターのカウントが広い線形動作範囲にわたって、テストされた細胞株のための信頼性の高い方法であるを示しています。
4. セプターのカウントの全体的な相対精度は、セプターのカウントから得られたデータは、コールターのカウントから得られたカウントと比較されている図2に示されている。
5. セプターの細胞数のログは、コールターのカウントのログに対してプロットし、テストしたすべての細胞株を越え、セプターの数はコールター数に一致する、を示しています。
6. 19細胞株のカウントがZ2コールターカウンター、セプターのセルカウンター、Viのセルまたは無数のシステム、およびhemocytemeterなどの自動視覚ベースのカウンタを用いて行った。
7. カウントは、サスペンションと同一の希釈液を開始し、同じセルを使用して、メーカーの指示に従って行った。図3に示す結果は、セプターで測定された細胞の濃度が密接に高い直線性を持つ理論的な細胞濃度に一致数えることを示している。
8. ％の変動係数、またはCVは、それぞれのカウントシステムのための各細胞株のそれぞれの希釈を計算した。図4は、細胞濃度とカウント方法に関しては、19細胞株の平均％のCVを示す。
9. 動作範囲内で、セプターの細胞計数は小さく、標準偏差と変動の小さい平均係数を表示し、視覚ベースの血球計計数よりも正確です。
10. セプターのカウントは10倍の血球計算法よりも速く、あまりにも他の自動化されたカウンタよりも高速です。図5、SF9、MCF7、およびHEK293細胞ではこのビデオで説明する方法を用いてカウントした。
11. 細胞濃度を測定するために必要な平均時間を記録した。血球計算法は、サンプルごとに一度だけ実行されたことに注意してください。
12. セプターは、セルサイズに基づいて測定を行います。したがって、細胞形態の変更については、ヒストグラムに取り込むことができます。健全な文化は、不健康な細胞をしながら、素敵なベル形のガウス分布を表示し溶解、そして左にヒストグラム（図6、左パネル）のシフトを引き起こす。
13. 同様に、50％の死細胞の人口が50％、生細胞と混合した場合、ヒストグラムのシフトも（図6、右のパネル）が観察された。

Discussion

他のカウントの方法からの結果にセプターのセルカウンタのパフォーマンスを比較すると、我々はこの新しい携帯、自動細胞計数器は、広い動作範囲にわたって正確に、速く、信頼性の高い細胞数を提供すると結論付けている。セプターのカウントの機能は、センサー先端部とコールター原理に基づく洗練されたカウントの計測に埋め込まれた精密エンジニアリング技術の結果です。パフォーマンスの質は速度を上げるとセルベースアッセイの再現性を向上させる方法としてカウントセプターを示唆している。ハンドヘルドの形式は、細胞培養のフードで迅速な退屈フリーカウント権利を許可します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20040
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20060
Scepter Sensors, 60 μm	EMD Millipore	PHCC60050	50 Pack of sensors
Scepter Sensors, 40 μm	EMD Millipore	PHCC40050	50 Pack of sensors
Universal Power Adapter	EMD Millipore	PHCCPOWER
Scepter O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 O-rings and one filter cover