Summary
Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.
Abstract
La scoperta nel 2006 che fibroblasti umani e mouse potrebbe essere riprogrammato per generare cellule iPS 1-3 con caratteristiche molto simili alle cellule staminali embrionali ha creato una nuova fonte preziosa di cellule pluripotenti per la scoperta di farmaci, terapia cellulare, e la ricerca di base.
Mezzi di comunicazione GIBCO e reagenti sono stati in prima linea nella ricerca sulle cellule staminali pluripotenti da anni. Knockout DMEM integrato con sostituzione Knockout siero è il media di scelta per la crescita delle cellule staminali embrionali e ora di cellule iPS cultura 3-9. Il gold standard del sistema dei media può ora essere utilizzato per alimentazione priva di cultura con l'aggiunta di Cocktail SR Factor Knockout crescita.
Tradizionale ES umane e metodi di coltura delle cellule iPS richiedono l'uso di mouse o strati alimentatore fibroblasti umani, o l'alimentatore condizionata media. Questi metodi sono cultura alta intensità di lavoro, difficili da scalare ed è difficile mantenere anche le cellule indifferenziate a causa delle condizioni indefinito. Invitrogen ha sviluppato SR Knockout Cocktail fattore di crescita per consentire facilmente la tua transizione colture cellulari anche alla rinfusa, senza pur mantenendo l'uso di SR Knockout.
Protocol
Nota: Per mantenere condizioni di coltura sterili, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuate utilizzando pratiche di laboratorio sterile e condotto sotto una cappa a flusso laminare.
Prima di iniziare, assicurarsi che i media sono equilibrati a 37 ° C e opportunamente gasati.
Preparazione Geltrex rivestita Piatti Cultura
Nota: vedi appendice per l'utilizzo di piatti della cultura CELLstart rivestiti
- Scongelare un tubo di Geltrex (1 ml) lentamente a 2-8 ° C e diluire 1:100 in 99 ml di Knockout D-MEM/F-12. Mescolare delicatamente la soluzione.
Nota: alcune linee di cellule iPS possono richiedere una diversa diluizione Geltrex per una crescita ottimale. Vedi appendice per le diluizioni alternative. - Coprono l'intera superficie di ogni piatto cultura con la soluzione Geltrex (1 mL per un piatto da 35 mm, 1,5 ml per un piatto di 60 mm).
- Sigillare ogni piatto con Parafilm contro l'essiccamento e incubare i piatti per 1 ora a 37 ° C.
Nota: A questo punto si può memorizzare il Geltrex rivestite piatti di cultura a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Sigillare ogni piatto con Parafilm per evitare che il Geltrex si secchi. - Prima di utilizzare, trasferire il Geltrex rivestite piatti di una cappa a flusso laminare e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 1 ora).
Preparazione completa alimentatore-Free SR KnockOut Media
- Per preparare 1 mL di 10 mg / ml soluzione di base FGF, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino a 6 mesi.
Di base FGF 10 mcg D-PBS 990 microlitri 10% di BSA 10 L
Nota: BSA può essere sostituito con HSA o SR Knockout alla stessa concentrazione. - Per preparare 50 ml di 2 mg / ml soluzione dispasi, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Filtrare la soluzione sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
Dispasi 100 mg D-PBS 50 mL - Per preparare 100 mL di SR KnockOut completo alimentatore-Free (KSR-FF) medium asettico combinare i componenti elencati nella tabella sottostante.
Si può memorizzare il KSR-FF medio a 2-8 ° C per un massimo di una settimana.Componente Concentrazione magazzino Concentrazione finale Volume Knockout DMEM/F12 (n ° cat. 12660-012) - 1X 76,8 mL GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) 200 mM 2 mM 1 ml KnockOut SR (n ° cat. 10828-028) - 20% 20 ml KnockOut SR-GFC (n ° cat. A10580-01) 50X 1X 2 ml bFGF (cat. no. PHG0024) 10 mcg / ml 20 ng / mL 200 l - Poco prima di pre-raggiunga l'equilibrio completo a temperatura e gas, in modo asettico aggiungere il volume richiesto di 2 mercaptoetanolo (55 concentrazione magazzino mm) per una concentrazione di 0,1 mM finale. Ad esempio, per preparare 100 ml di KSR-FF medio aggiungere 182 microlitri di 55 mM di 2-mercaptoetanolo (diluizione 1:550) In alternativa, il 2-mercaptoetanolo possono essere aggiunti al mezzo di 1X completato e conservato a 2-8 ° C per fino ad una settimana.
Adattamento iPSCs a KSR-FF Media
- Prima di iniziare, pre-equilibrare i vostri piatti Geltrex rivestito a temperatura ambiente nel cappuccio.
- Cultura iPSCs sulle cellule alimentatore MEF fino a quando sono 70-80% confluenti. Fare riferimento al manuale GIBCO fibroblasti embrionali di topo per MEF protocolli basati su cultura. Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti.
- Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti.
- Aspirare il terreno dai piatti della cultura, e aggiungere una quantità appropriata di soluzione dispasi. Incubare i piatti a 37 ° C per 3-5 minuti.
- Aspirare la soluzione dispasi da ciascun recipiente di coltura e lavare le cellule MEF alimentatore delicatamente con D-PBS (2 a 3 volte).
- Aggiungere una quantità appropriata di terreno completo SR KnockOut a ciascun recipiente di coltura. Utilizzare un raschietto cella o un pipetta da 5 ml per raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del recipiente di coltura.
Nota: vedi appendice per i protocolli di adattamento alternativa è difficile adattare le linee di cellule iPS, - Raccogliere la sospensione cellulare da ogni piatto cultura in separata provette da 15 ml conica. Sciacquare ciascun recipiente di coltura con una quantità appropriata di terreno completo SR ad eliminazione diretta, e aggiungere il D-PBS risciacquare medio in provette da 15 ml contenente la sospensione cellulare. Essere cauti a non rompere i grumi di cellule in cellule singole
- Centrifugare le provette da 15 ml a 200 xg per 5 minuti per far sedimentare il iPSCs.
- Aspirare il surnatante dal pellet IPSC. Risospendere il precipitato in una quantità appropriata di KSR-FF medio in base al rapporto di divisione (Tabella 1). Non rompere i grumi di cellule a una dimensione inferiore, perché le macchie più piccole non attaccano bene alla superficie.
Nota: Si consiglia un rapporto di divisione di 1:2 per i primi 3 passaggi dopo il iPSCs sono stati diversi passaggi direttamente dal Media IPSC Cultura MEF per KSR-FF media. Normalmente, un rapporto di divisione 1:03-1:05 è appropriato, ma passaging a 1:2 garantisce la maggiore densità di cellule necessarie per l'adattamento in un alimentatore senza cultura. - Prima di placcatura del iPSCs su piatti Geltrex patinata, aspirare residui soluzione Geltrex da preverniciato piatto, e aggiungere lentamente una quantità appropriata di sospensione cellulare per ogni piatto cultura. Nota: non lavare i piatti prima di placcatura.
- Spostare il piatto della cultura avanti e indietro e di lato a lato diverse volte per disperdere le cellule sulla superficie del piatto. Delicatamente la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C con atmosfera umidificata da 4 a 6% di CO 2 in aria. Sostituire il medio trascorso con KSR-FF ogni giorno.
Passaging cellule umane iPS usando KSR-FF
- Osservare le iPSCs umano cresce in completo KSR-FF sotto il microscopio per confermare che le cellule sono 70-80% confluenti e pronto per essere sottocoltura. Fare riferimento alla Figura 1.
Nota: Se le colonie diventano troppo dense o troppo grande, si verifica una maggiore differenziazione. - Tagliare e rimuovere eventuali colonie differenziati IPSC prima passaging la cultura.
- Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti.
- Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti.
- Aspirare il terreno trascorso dalla nave cultura con una pipetta, e lavare le cellule due volte con D-PBS.
- Aggiungere delicatamente preriscaldato soluzione dispasi alla nave cultura (ad esempio, 1 mL di soluzione dispasi per 60 mm piatto di cultura). Agitare il recipiente di coltura per ricoprire l'intera superficie delle cellule.
- Incubare il recipiente di coltura a 37 ° C per 3 minuti.
- Rimuovere il recipiente dal termostato, aspirare la soluzione dispasi, e lavare delicatamente le cellule con D-PBS.
- Raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto cultura utilizzando un raschietto cellula, e trasferire le cellule in una provetta sterile centrifuga 15ml.
- Lavare il piatto cultura due volte con KSR-FF, dolcemente "spruzzo off" tutte le cellule che non si sono staccati. Piscina di risciacquo medio con le cellule nel tubo 15ml.
- Centrifugare la provetta a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule.
- Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule e smaltirlo.
- Picchiettare lievemente la provetta per rimuovere completamente il pellet dal fondo del tubo.
- Risospendere delicatamente le cellule in fase di pre-equilibrato KSR-FF con una pipetta 5 ml sierologico. Non triturare. Nota: è fondamentale nella fase di risospendere delicatamente le cellule senza usare la forza per evitare danni.
- Trasferire le cellule in una nuova di 60 mm Geltrex rivestite piatto al rapporto di divisione desiderato e spostare il piatto della cultura avanti e indietro e di lato a lato diverse volte per disperdere le cellule in tutta la sua superficie.
- Porre la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C con atmosfera umidificata al4 al 6% di CO 2 in aria.
- Il giorno seguente, gentilmente sostituire il medio trascorso con KSR-FF per rimuovere i detriti cellulari. Sostituire il medio speso tutti i giorni dopo. Osservare le cellule iPS quotidiana e il passaggio in base alle esigenze (circa ogni 4-5 giorni). Passaging è consigliato quando le cellule raggiungono il 70-80% confluenza. Per la crioconservazione delle cellule iPS e disgelo, fare riferimento al nostro protocollo dal titolo "Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media".
Risultati attesi
Figura 1. L'immagine a contrasto di fase che segue mostra iPSCs coltivate su Geltrex rivestite con piatti della cultura completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut media. La mostra iPSCs morfologia simile alle hESC, caratterizzato da nuclei di grandi dimensioni e scarso citoplasma. (Ingrandimento 40x)
| Componente | 35 millimetri Piatto | Piatto 60 millimetri | Dish 100 millimetri |
| Completa KnockOut SR media | 2 ml | 4 mL | 10 mL |
| Geltrex Soluzione | 1 ml | 1,5 ml | 4-5 mL |
| Dispasi | 0,5 ml | 1 ml | 3-4 ml |
| D-PBS per il risciacquo | 2 ml | 4 mL | 10 mL |
Tabella 1. I volumi consigliati
Disclosures
Gli autori di questo articolo sono impiegati da Life Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | Cat. no. 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products | |
| GlutaMAX-I | Cat. No. 35050-061 | ||
| KnockOut Serum Replacement | KnockOut SR, Cat. no. 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | bFGF, Cat. no. PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | Cat. no. 21985-023 | ||
| Dispase | Cat. no. 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods. | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | Cat. no. A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | Cat. no. 14190-144 | ||
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60mm Tissue Culture treated dishes |
References
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