Feeder-Free Anpassning, kultur och Passaging av mänskliga iPS-celler med hjälp av Komplett Knockout Serum Byte Feeder-Free Medium

Summary

Följande protokoll innehåller instruktioner för att anpassa människa inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler till feeder-fri kultur med hjälp av kompletta Knockout Serum Byte Feeder-Free medium (KSR-FF). När anpassad, instruktioner för kontinuerlig underhåll finns också.

Abstract

Upptäckten 2006 att mänskliga och musfibroblaster kan programmeras att generera iPS-celler ^1-3 med kvaliteter anmärkningsvärt liknar embryonala stamceller har skapat en värdefull ny källa av pluripotenta celler för läkemedelsutveckling, cellterapi och grundforskning.

GIBCO media och reagens har legat i framkant av pluripotenta stamcellsforskning år. Knockout DMEM kompletteras med Knockout Serum Byte är medierna i valet för embryonala stamceller tillväxt och nu iPS cellodling ^3-9. Detta guldmyntfoten media system kan nu användas för feeder-fri kultur med tillägg av Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Traditionella mänskliga ES och iPS cell metoder kultur kräver användning av mus eller människa fibroblast lager feeder eller matare med luftkonditionering medium. Dessa kultur metoder är arbetsintensiva, svåra att skala och det är svårt att hålla höfterna cellerna odifferentierade grund av odefinierade villkor. Invitrogen har utvecklat Knockout SR Cocktail Growth Factor så att du enkelt övergången höfterna cellkulturer till feeder-fri och samtidigt bibehålla din användning av Knockout SR.

Protocol

OBS: För att bibehålla sterila odlingsbetingelser, är alla förfaranden i detta protokoll utföras med steril laboratoriesed och utföras i dragskåp huva.

Före start, se till att alla media är jämvikt till 37 ° C och lämpligt gasade.

Förbereda Geltrex-belagd kultur rätter

OBS: se bilaga för användningen av CELLstart belagda kultur rätter

1. Tina en tub Geltrex (1 ml) långsamt vid 2-8 ° C och späd 1:100 den i 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Blanda lösningen försiktigt.
   
   Obs: Vissa iPS-cell-linjer kan kräva en annan Geltrex utspädning för optimal tillväxt. Se bilaga för alternativa spädningar.
2. Täck hela ytan på varje kultur maträtt med Geltrex (1 ml för en 35-mm maträtt, 1,5 ml för en 60-mm maträtt).
3. Försegla varje maträtt med Parafilm att förhindra uttorkning och inkubera disken under 1 timme vid 37 ° C.
   
   OBS: På denna punkt kan du lagra Geltrex-belagda kultur rätter vid 4 ° C i upp till en månad. Försegla varje maträtt med Parafilm för att förhindra att Geltrex från att torka ut.
4. Innan du använder, överföra Geltrex-belagda rätter till ett laminärt flöde huva och ge dem möjlighet att anta rumstemperatur (ca 1 timme).

Förbereda Komplett Feeder-Free Knockout SR Medium

1. För att förbereda 1 mL 10 mikrogram / ml Grundläggande FGF lösning, aseptiskt blanda komponenter som anges nedan. Alikvotera lösningen och förvara vid -20 ° C i upp till 6 månader.
   
   

   Grundläggande FGF	10 mikrogram
   D-PBS	990 mikroliter
   10% BSA	10 mikroliter

   
   
   Obs: BSA kan ersättas med HSA eller Knockout SR på samma koncentration.
2. För att förbereda 50 ml av 2 mg / ml Dispase lösning, aseptiskt blanda komponenter som anges nedan. Filtrera sterilisera lösningen och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
   
   

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. För att bereda 100 ml komplett Knockout SR Feeder-Free (KSR-FF) medium aseptiskt kombinera de komponenter som anges i tabellen nedan.
   
   

   Komponent	Stock Koncentration	Slutlig koncentration	Volym
   Knockout DMEM/F12 (kat. nr. 12.660-012)	-	1X	76,8 ml
   GlutaMAX-I (kat. nr 35.050-061)	200 mm	2 mM	1 ml
   Knockout SR (kat. nr. 10.828-028)	-	20%	20 ml
   Knockout SR-GFC (kat. nr. A10580-01)	50X	1X	2 ml
   bFGF (kat. nr. PHG0024)	10 mikrogram / ml	20 ng / ml	200 mikroliter

   Du kan lagra KSR-FF medel vid 2-8 ° C i upp till en vecka.
4. Strax före pre-utjämnande hela medellång till temperatur och gaser, tillsätt aseptiskt erforderlig volym 2 merkaptoetanol (55 mm lager koncentration) för en 0,1 mM slutlig koncentration. Till exempel att bereda 100 ml av KSR-FF medelstora lägga 182 mikroliter av 55 mm 2-merkaptoetanol (1:550 utspädning) Alternativt kan två-merkaptoetanol läggas till 1X färdig medium och förvaras vid 2-8 ° C för upp till en vecka.

Anpassning iPSCs till KSR-FF Medium

1. Före start, före balansera din Geltrex belagda rätter till rumstemperatur i huven.
2. Kultur iPSCs om MEF matare cellerna tills de är 70-80% konfluenta. Se GIBCO Mouse embryonala Fibroblast handbok för MEF-baserade kultur protokoll. Förvärma erforderlig volym Dispase i ett 37 ° C vattenbad. Se tabell 1 nedan för information om volymer som behövs.
3. Pre-jämvikt erforderlig volym KSR-FF i 37 ° C vattenbad for15 min. Se tabell 1 nedan för information om volymer som behövs.
4. Sug mediet från den kultur rätter, och lägg till lämplig mängd Dispase lösning. Inkubera rätter på 37 ° C i 3-5 minuter.
5. Aspirera Dispase lösningen från varje kultur fartyget och tvätta cellerna MEF mataren försiktigt med D-PBS (2 till 3 gånger).
6. Tillsätt en lämplig mängd kompletta Knockout SR medellång till varje kultur fartyg. Använd en cell skrapa eller en 5 ml-pipetten för att försiktigt skrapa celler från ytan av kultur fartyg.
   
   OBS: se bilaga för alternativa anpassning protokoll för svårt att anpassa iPS cellinjer,
7. Samla cellsuspensionen från varje kultur rätt i separata 15 ml koniska rör. Skölj varje kultur fartyg med en lämplig mängd kompletta Knockout SR medium och tillsätt D-PBS skölja mediet i 15 ml koniska rör med cellsuspensionen. Var försiktig med att inte bryta cellen klumpar i enstaka celler
8. Centrifugera 15 ml koniska rör vid 200 xgi 5 minuter till pellets i iPSCs.
9. Aspirera supernatanten från IPSC pelleten. Återsuspendera pelleten i en lämplig mängd KSR-FF Medium enligt delningsfaktorn (tabell 1). Bryt inte cellen klumpar till en mindre storlek, eftersom de mindre klumpar inte fäster bra till ytan.
   
   Obs: Vi rekommenderar en split 1:2 för första 3 stycken efter iPSCs har passerats direkt från IPSC MEF odlingsmediet till KSR-FF medium. Normalt är en delningsfaktorn 1:03 till 01:05 så är lämpligt, men passaging vid 01:02 säkerställer högre täthet av celler behövs när anpassningen till en feeder-fri kultur.
10. Innan bordläggning av iPSCs på Geltrex belagda rätter, aspirera kvarvarande Geltrex lösning från pre-belagda maträtt, och långsamt lägger en lämplig mängd cellsuspension att varje kultur rätt. OBS: Skölj inte disken innan plätering.
11. Flytta kulturen skålen fram och tillbaka och från sida till sida flera gånger för att skingra de celler över ytan av skålen. Placera försiktigt kulturen skålen i en 37 ° C inkubator med en fuktig atmosfär av 4 till 6% CO ₂ i luften. Byt ut det använda mediet med KSR-FF varje dag.

Passaging mänskliga iPS-celler med hjälp av KSR-FF

13. Observera mänskliga iPSCs växer i hela KSR-FF under mikroskop för att bekräfta att cellerna är 70-80% konfluenta och redo att omodlas. Se figur 1.
    
    Obs: Om samhällena blir för tät eller för stor, uppstår en ökad differentiering.
14. Klipp ut och ta bort eventuella differentierade IPSC kolonier före passaging kulturen.
15. Förvärma erforderlig volym Dispase i ett 37 ° C vattenbad. Se tabell 1 nedan för information om volymer som behövs.
16. Pre-jämvikt erforderlig volym KSR-FF i 37 ° C vattenbad for15 min. Se tabell 1 nedan för information om volymer som behövs.
17. Aspirera det använda mediet från den kultur fartyget med hjälp av en pipett och spola cellerna två gånger med D-PBS.
18. Tillsätt försiktigt förvärmda Dispase lösning på den kultur fartyget (t.ex. 1 ml Dispase lösning per 60-mm kultur maträtt). Snurra kultur fartyget att belägga hela cellytan.
19. Inkubera kulturen fartyget vid 37 ° C i 3 minuter.
20. Ta bort fartyget från inkubatorn, aspirera Dispase lösningen, och försiktigt tvätta cellerna med D-PBS.
21. Försiktigt skrapa cellerna på ytan av den kultur maträtt med hjälp av en cell skrapa, och överföra celler till en steril 15 ml centrifugrör.
22. Skölj kulturen skålen två gånger med KSR-FF, försiktigt "sprutning av" alla celler som inte har lossnat. Pool skölj mediet med celler i 15ml tub.
23. Centrifugera röret vid 200 xgi 5 minuter vid rumstemperatur till pellets cellerna.
24. Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och kassera den.
25. Knacka försiktigt på röret för att helt få bort cellpelleten från röret botten.
26. Försiktigt resuspendera cellerna i pre-jämvikt KSR-FF med hjälp av en 5 ml serologisk pipett. Inte kör det. Obs: det är viktigt i det steg för att försiktigt resuspendera cellerna utan att använda våld för att undvika skador.
27. Överför cellerna till en ny 60-mm Geltrex-belagd maträtt på önskad delningsfaktorn och flytta kulturen skålen fram och tillbaka och från sida till sida flera gånger för att skingra celler inom hela dess yta.
28. Placera kulturen skålen i en 37 ° C inkubator med en fuktad atmosfär av4 och 6% CO ₂ i luften.
29. Nästa dag försiktigt byta ut det använda mediet med KSR-FF för att ta bort cell skräp. Byt ut det använda mediet vardagen därefter. Observera iPS-celler dagligen och passage dem vid behov (ca var 4-5 dagar). Passaging rekommenderas när cellerna når 70-80% sammanflödet. För iPS cell frysförvaring och upptining, se våra protokoll med titeln "Cryopreserving och återställa de mänskliga iPS-celler med hjälp av Komplett Knockout Serum Byte Feeder-Free Medium".

Förväntade resultat

Figur 1. Faskontrast Bilden nedan visar iPSCs odlas på Geltrex-belagd kultur rätter med komplett Knockout Serum Byte Feeder-Free medium. Den iPSCs uppvisar morfologi som hESCs, kännetecknas av stora kärnor och knappa cytoplasman. (40x förstoring)

Komponent	35mm Dish	60mm Dish	100mm Dish
Komplett Knockout SR medelstora	2 ml	4 mL	10 ml
Geltrex Lösning	1 ml	1,5 ml	4-5 mL
Dispase	0,5 ml	1 ml	3-4 mL
D-PBS för sköljning	2 ml	4 mL	10 ml

Tabell 1. Rekommenderad Volymerna

Klicka här för att se appendix .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes