Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.
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Articolo metodologico
Produzione di estratto di Chick dell'embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale 1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale 2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso 6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto 10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell'embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.
Protocollo
Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).
Parte 1: Impostazione (non mostrato in video)
PREPARAZIONE MATERIALI E SOLUZIONI (prima di prendere le uova fuori dell'incubatore)
- Le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato per 11 giorni a 37....
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Discussione
Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono diversi .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il supporto e la consulenza di Markus Pajtler e Robert Bohrer sono stati preziosi per la visualizzazione di questo protocollo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Uova di pollo incubate per 11 giorni | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Disinfettante alcolico in spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Siringa sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubi sterili (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Punte per pipetta sterili | Starlab GmbH | ||
| Ialuronidasi tipo IV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Stericup Milipore sterili (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipette sterili (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuga L5-50 | Rotor tipo Ti-45 |
Riferimenti
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 7....
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Ristampe e permessi
