Summary
Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.
Abstract
Kwantificering van DNA, vooral in kleine concentraties, is een belangrijke taak met een breed scala van biologische toepassingen, waaronder standaard moleculaire biologie assays, zoals de synthese en zuivering van DNA, diagnostische toepassingen zoals kwantificering van DNA-amplificatie producten, en detectie van DNA-moleculen in drugs preparaten. Tijdens deze video demonstreren we de mogelijkheden van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een Micro Plate Reader accessoire voor dsDNA kwantificeren met behulp van Molecular Probes Quant-it PicoGreen kleurstof reagens kit uit te voeren.
De F-7000 fluorescentie Spectrophotometer biedt een hoge gevoeligheid en hoge snelheid metingen. Het is een zeer flexibel systeem geschikt voor het meten fluorescentie, luminescentie, en fosforescentie. Het meten van verschillende modi beschikbaar, waaronder golflengte scan, tijd scan, fotometrie en 3-D scan meting. De spectrofotometer heeft gevoeligheid in het bereik van 50 picomol van fluoresceïne bij het gebruik van een 300 il monster volume in de microplaat, en is geschikt voor het meten scansnelheden van 60.000 nm / minuut. Het heeft ook een breed dynamisch bereik van maximaal vijf ordes van grootte die het mogelijk maakt voor het gebruik van de kalibratie krommen over een breed scala aan concentraties. Het optische systeem maakt gebruik van alle reflecterende optiek voor maximale energie en gevoeligheid. De standaard golflengte is 200 tot 750 nm, en kan worden uitgebreid tot 900 nm bij het gebruik van een van de optionele nabij-infrarode fotomultiplicatoren. Het systeem maakt het mogelijk optionele temperatuurregeling voor de plaat lezer 5 tot 60 graden Celsius met behulp van een optionele externe temperatuur gecontroleerde vloeistof circulator. De microplaat lezer maakt het gebruik van de 96 goed microplaten, en het meten van snelheid voor 96 wells is minder dan 60 seconden bij gebruik van de kinetiek mode.
Software controles voor de F-7000 en Microplate Reader zijn ook zeer flexibel. Monsters kunnen ingesteld worden op het kolom of rij-formaten, en een combinatie van bronnen kan worden gekozen voor monster metingen. Dit zorgt voor een optimale benutting van de microplaat. Daarnaast is de software maakt het importeren van micro plaat monster configuraties gemaakt in Excel en opgeslagen in door komma's gescheiden waarden, of "csv" formaat. Microplaat het meten van configuraties kunnen worden opgeslagen en opgeroepen door de software voor het gemak en verbeterde productiviteit. Gegevens resultaten kunnen naar een standaard rapport, naar Excel, of op een optionele Report Generator Program.
Protocol
1. Instrument Setup
- Zet de spectrofluorometer en laat opwarmen gedurende 1 uur.
- Met behulp van Excel een bestand met de normen en Sample data, zoals weergegeven in figuur 1 en sla het op in gescheiden door komma's waarden "csv" formaat.
Figuur 1. Standaarden en monsters gegevens. - Stel fluorometer als volgt:
- Klik op de
drukt, wordt dit open de analysemethode venster, zoals getoond in fig. 2. 
Figuur 2. Methode Window, tabblad Algemeen.
Maak de volgende selecties:- In de "meting" veld selecteert u Fotometrie uit het pull-down menu.
- In "Operator" veld, voert u de juiste operator naam.
- Het is niet nodig om informatie in te voeren in het "Instrument" veld. Dit wordt automatisch geselecteerd door de software.
- De "Sampling" veld is niet actief bij het gebruik van de microplaat lezer.
- Voer eventueel opmerkingen die je misschien wilt opnemen in het rapport in de "Opmerkingen" veld.
- In de "Accessoire" veld, voert u informatie over de accessoires die voor deze test.
- Let op de knoppen aan de rechterkant van het venster.
- De "Load" knop maakt het mogelijk het laden van eerder opgeslagen analysemethoden.
- De "opslaan" knop laat het bijwerken van een reeks van te testen parameters of Analysis Method eerder opgeslagen en geladen, met dezelfde naam.
- De "Save As" knop kunt u een nieuwe reeks van te testen parameters of Analysis Method onder een gewenste naam.
Figuur 3. Methode Window, Kwantificering tabblad.- In de "Kwantificering type" veld selecteert u Golflengte. Dit geeft aan dat de fluorescentie lezing zal worden gemaakt met behulp van de geselecteerde golflengte.
- In het "Kalibratie type" veld selecteert u een st bestellen.
- In het "Aantal golflengten" de optie 1.
- In de "concentratie-eenheid" veld ng / mL.
- Laat ongeselecteerde de vakjes voor "Manual Kalibratie" en "Force curve door nul".
- In de "Digit na komma" de optie 2.
- In de "lagere concentratie limit" veld, voert u 0.
- In de "Upper concentratiegrens veld 10000.
Klik nu op de "Instrument" tab en voer de volgende selecties.
Figuur 4. Methode venster, Instrument tabblad- In de "Data mode:" veld selecteert u Fluorescentie.
- De "Hakken snelheid" veld is niet actief op dit moment is het alleen wordt gebruikt voor fosforescentie metingen.
- In de "Wavelength mode" veld, selecteert u zowel WL vast.
- In de "EX / WL1" veld 480Nm.
- In het "EM / WL1" veld 520nm.
- Alle andere velden onder EX en de EM zijn niet actief op dit moment.
- In de "EX gleuf" veld te selecteren 5.0nm uit het pull-down menu.
- In de "EM gleuf" veld te selecteren 5.0nm uit het pull-down menu.
- Laat ongeselecteerde de box voor de "PMT Voltage 1-1000V" veld.
- In de "PMT Voltage" de optie 700V uit het pull-down menu.
- In de "Auto statistiek calc. Number" veld te selecteren 2.
- In het 'dupliceert "veld te selecteren 1.
- In de "Integratie tijd" veld te selecteren 0,1 s. </ Li>
- In de "vertraging" veld of selecteer 0s.
Figuur 5. Methode venster, tabblad Beeldscherm.- In de "Y-as", "Max:" veld selecteert u 10000
- In de "Y-as", "Min:" veld selecteert u 0.
- Selecteert u het vakje aan de linkerkant van het "Open data verwerking na de data-acquisitie".
- Laat niet-geselecteerde het vak aan de linkerkant van de "Print rapport na data-acquisitie", tenzij u een rapport automatisch afgedrukt nadat de metingen zijn voltooid.
Figuur 6. Methode venster, Rapport Tab.- In het veld "Output", selecteert u Afdrukken Verslag van de pull-down menu. Je kon ook kiezen voor "Use Microsoft Excel" als je wilt dat de gegevens geëxporteerd naar Excel, of "Gebruik Print Generator Sheet" Als u de optionele add-on programma Report Generator waardoor het genereren van op maat gemaakte rapporten.
- Klik op de vakjes voor de items die u wilt worden opgenomen in het rapport.
- Voor het opslaan van alle geselecteerde parameters in de verschillende tabbladen van de "Analyse Methode" venster, klikt u nogmaals op het tabblad "Algemeen" en deze opslaan onder een bestandsnaam en een locatie waar je ze kunt vinden voor toekomstig gebruik, en klik op de " OK "knop om dit venster te sluiten.
- Hiermee is het opzetten van het instrument te testen parameters.
- Nu zullen we het opzetten van de microplaat lezer.
- Klik op de
knop, die de MPR Setup venster zal brengen op de top.
Figuur 7. MPR Setup venster, Plate tabblad.- Klik op de A1 positie en sleep de muis naar E1, klik dan op de
knop te drukken. Hierdoor wordt de standpunten die worden gebruikt voor de normen. Deze posities worden gemarkeerd in groene kleur. - Nu moeten we posities F1 te selecteren H3 voor de monsters. Klik en sleep de muis vanaf positie F1, tot H3 positie en klik dan op de
drukt, wordt dit hoogtepunt die posities in de gele kleur. - Herhaal dezelfde handeling voor posities A2 naar E3, die posities voor sample metingen te selecteren.
- Laten we nu laad het bestand Comma Separated Variable (csv-bestand) van tevoren voorbereid met de standaarden en Sample informatie.
Figuur 8. MPR Setup-venster, Well tabblad Informatie.- Klik dan op de
knop te drukken. Een Windows Verkenner-venster geopend, die zoals weergegeven in figuur 9, waardoor het lokaliseren van de "Nou information.csv" bestand en het laden. 
Figuur 9. Het laden van goed sample informatie.
Na het laden van de "Well informatie" file, zal de "Well informatie" zoals weergegeven in Figuur 10 kijken
Figuur 10. Geladen monster goed informatie.
- Klik op de
drukt, wordt dit open de analysemethode venster, zoals getoond in fig. 2. 
knop, die de MPR Setup venster zal brengen op de top. 
knop te drukken. Hierdoor wordt de standpunten die worden gebruikt voor de normen. Deze posities worden gemarkeerd in groene kleur. 
drukt, wordt dit hoogtepunt die posities in de gele kleur. 
knop te drukken. Een Windows Verkenner-venster geopend, die zoals weergegeven in figuur 9, waardoor het lokaliseren van de "Nou information.csv" bestand en het laden. 
2. Picogreen Assay Monstervoorbereiding
- Bereid 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) door het toevoegen van 1 ml van 20 X TE-buffertot 19 ml dI H 2 O.
- Bereid PicoGreen reagensoplossing door toevoeging van 50 pi 200 X PicoGreen Reagens tot 9,95 ml 1 x TE-buffer.
- Bereid normen (Lambda dsDNA) door het maken van seriële verdunningen van voorraad dsDNA (100 ug / ml). Eerst een oplossing van 50 ug / ml dsDNA door toevoeging van 25 pi van de voorraad dsDNA (100 ug / ml) en 25 il 1 x TE-buffer. Maak vervolgens de standaardoplossingen door de toevoeging van de aangegeven volumes van dsDNA en buffer zoals vermeld in de onderstaande tabel:
Concentratie van dsDNA Volume van dsDNA Volume van de buffer 1 ug / ml 20 pi van 50 ug / ml dsDNA 980 pi 1 X TE-buffer 0,1 ug / ml 100 ul van 1 ug / ml dsDNA 900 pi 1 X TE-buffer 0,01 microgram / ml 100 pi van 0,1 ug / ml dsDNA 900 pi 1 X TE-buffer 0.001 ug / ml 100 pi van 0,01 ug / ml dsDNA 900 pi 1 X TE-buffer
3. Meting van Normen en Sample Fluorescentie
- Pipetteer 150 ul van elke standaard in putten A1-E1 van een 96 wells-plaat, per figuur 7, en volgens de volgende tabel:
Goed Standaard A1 1 ug / ml B1 0,1 ug / ml C1 0,01 microgram / ml D1 0.001 ug / ml E1 1 X TE-buffer - Pipetteer 150 ul onbekende monsters in putten F1 tot H3, afgebeeld in figuur 7
- Giet PicoGreen bereide oplossing in stap 1.2 in een goot is ontworpen voor multi-channel pipet te gebruiken. Gebruik een multi-channel pipet tot 150 pi PicoGreen oplossing voor de putten A1-H3 te leveren. Meng oplossing en normen voorzichtig met pipet.
- Laat de plaat in een donkere omgeving en wacht 2-5 minuten voor de reactie te ontwikkelen.
4. Representatieve resultaten
Een goede kalibreringskromme wordt geëvalueerd aan de hand van de verschillende parameters die door de F-7000-software op de meting van de normen en de berekening van de ijklijn door de software.
De bepaling coëfficiënt geeft de goodness of fit van de gemeten normen en de berekende kalibratiecurve. Hoe dichter deze waarde op "1", hoe beter de pasvorm van de gemeten waarde en de kalibratiecurve.
Als de waarde is verre van "1", moeten de normen opnieuw te worden gemeten, opnieuw bereid, of de geschiktheid van de kalibratiecurve veranderd.
Figuur 11 toont een voorbeeld van een kalibratie-curve met een berekende vastberaden coëfficiënt = 0,99993, verkregen voor de kwantificering van dsDNA met behulp van PicoGreen kleurstof.
Figuur 11. Voorbeeld van dsDNA kalibratiecurve.
Discussion
Zorgvuldige pipetteren tijdens de monstervoorbereiding, alsmede het gebruik van een stabiele en gevoelige fluorescentie spectrofotometer is essentieel voor het verkrijgen van goede en reproduceerbare resultaten.
In het geval van de fluorescentie spectrofotometer wordt gebruikt voor deze test wordt voorgesteld met behulp van 300 uL uiteindelijke steekproef volume in de microplaat lezer. Lager volume vermindert de gevoeligheid en een groter volume kan leiden tot kruisbesmetting tussen de putten.
Disclosures
Luis A. Moreno en Kendra L. Cox in dienst zijn van Hitachi High Technologies Amerika, die het instrument gebruikt in dit artikel oplevert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
