Une méthode simple et efficace pour transformer<em> Pantens Physcomitrella</em> Protoplastes est décrite. Cette méthode est adaptée à partir des protocoles de<em> Physocmitrella</em> Protonemal protoplastes et<em> Arabidopsis</em> Transformation de protoplastes de mésophylle<sup> 1</sup>.
La méthode présentée ici permet une transformation de l'ADN simple et cohérente dans des protoplastes Physcomitrella patens. Cette méthode a été initialement développé pour une Arabidopsis, mais ici nous avons démontré qu'il se comporte bien avec des protoplastes de Physcomitrella patens, une plante simple et différent. Par conséquent, cette méthode peut être appliquée à d'autres espèces végétales avec des modifications mineures. Modifications possibles pour l'optimisation incluent la concentration de protoplastes MMG, le temps d'incubation dans une solution de MMG et PEG / Ca. Nous avons choisi d'utiliser 60 ug d'ADN dans nos expériences de routine parce que le nombre de transformants augmente linéairement avec la concentration d'ADN jusqu'à ce point (tableau 1). Nous pourrions obtenir environ 7000 transformants transitoires ou 200 transformants stables sur une seule transformation de 60 ug d'ADN, qui permet de dépistage et d'analyse d'une grande population de plantes.
Les protoplastes transformés peuvent être réparties en milieu d'étalement de liquide ou PRM-T. Bien que l'efficacité de la régénération est plus faible lorsque milieu d'étalement liquide est utilisé, nous avons choisi cette méthode lorsque les protoplastes ont été transformées avec les plasmides superenroulé. Comme montré dans le tableau 1, les transformations fait avec l'ADN plasmidique superenroulé générer des transformants beaucoup plus et donc, nous pouvons encore obtenir un grand nombre de plantes avec des moyennes plaquage liquide. Par ailleurs, la propagation protoplastes avec milieu d'étalement liquide permet une régénération plus rapide, ce qui est important pour les expériences impliquant des phénotypes transitoires, telles que RNAi renverser expériences 9,15. En plus de l'absence de top agar permet d'isoler des plantes faciles pour immunomarquage et RT-PCR 9,15.
The authors have nothing to disclose.
BT est soutenu par la NSF (IOS 1002837)
Name of the reagent | Ingredient |
PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. |
PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. |
2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. |
MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |