Un click-chimica metodo basato che permette la rapida, etichettatura non invasivo, e robusto di alchini-tagged glicani in embrioni di zebrafish è descritto. Glicani Fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish in fase di gastrulazione fine erano ripreso in questo studio.
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Articolo metodologico
Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal
In questo articolo
Sommario
Abstract
Glicani di imaging in vivo è stato recentemente attivato utilizzando un bioorthogonal strategia giornalista chimica trattando cellule o degli organismi con monosaccaridi azide-o alchini-tag 1, 2. Il monosaccaridi modificato, elaborato dalla macchina biosintetica glicani, sono incorporati in glicoconiugati superficie cellulare. I tag bioorthogonal azide o alchini quindi consentire coniugazione covalente con sonde fluorescenti per la visualizzazione, oppure con sonde affinità per l'arricchimento e l'analisi glycoproteomic. Questo protocollo descrive le procedure normalmente utilizzate per l'imaging non invasivo di glicani fucosylated in embrioni di zebrafish, tra cui: 1) microiniezione di una cella-embrioni stadio con un PIL-5-alkynylfucose (PIL-FucAl), 2) l'etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish con azide coniugato fluorofori via Cu biocompatibile (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC), e 3) l'imaging mediante microscopia confocale 3. Il metodo descritto qui può essere facilmente esteso ad altre classi di visualizzare glicani, glicani contenenti ad esempio acido sialico 4 e N-acetilgalattosamina 5, 6, in zebrafish di sviluppo e in altri organismi viventi.
Protocollo
1. Uovo Raccolta e Dechorionation
- Raccogliere e trasferire le uova di pesce zebra piatto 35 millimetri di Petri, rimuovere l'acqua il più possibile e si aggiunge 1 mg / ml E Pronease nel medio embrione E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) per digerire il corion.
- Dopo 3-5 minuti, unire il piatto in un bicchiere pieno di pesci d'acqua (60 mg "Ocean istantanea" per litro distillata H 2 O), e delicatamente trasferire le uova nel becher e lasciare le uova di "caduta" in acqua.
- Lavare le uova con pesci d'acqua tre volte. La maggior parte delle uova saranno l....
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Discussione
Imaging biomolecole In vivo Fornisce spunti critici della loro attività biologica nel loro ambiente naturale. In questo video, ci dimostrano come l'etichettatura dei glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish è realizzato da microinjecting unicellulare embrioni stadio con il PIL-FucAl e una seconda fase coniugazione fluoroforo attraverso BTTES-mediata CuAAC biocompatibile 3. Etichettatura robusta può essere raggiunto entro 2-3 minuti, e il glicani etichett.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health (GM093282 di PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fondi di avvio di Albert Einstein College of Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Di rame (II) solfato pentaidrato | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| destrano, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-L-ascorbato di sodio | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acido | Acros Organics | 164060010 | |
| Con fondo di vetro piatto micropozzetti | MatTek | P35G-1.5-14-C |
Riferimenti
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D.
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Ristampe e permessi
