Summary
点击化学的方法,允许炔标签聚糖在斑马鱼胚胎的快速,非侵入性和强大的标签描述。在这项研究中,已故的原肠胚形成阶段,在斑马鱼胚胎的包围层Fucosylated聚糖成像。
Abstract
活体成像聚糖最近已经启用了一个bioorthogonal化学记者战略治疗叠氮或炔标记的单糖1,2细胞或生物体。修改后的单糖,聚糖的生物合成机制处理,纳入细胞表面的糖复合物。 bioorthogonal叠氮或炔标签用于可视化的荧光探针,然后让共价键共轭,或用浓缩和glycoproteomic分析的亲和力探头。这个协议描述fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的无创成像通常使用的,包括程序:1)单细胞阶段的胚胎显微注射与国内生产总值5 alkynylfucose(国内生产总值FucAl),2)标签包围层fucosylated聚糖通过生物 相容性铜(I)催化叠氮炔环加成反应(CuAAC),并通过共聚焦显微镜3 3)成像叠氮共轭荧光团的斑马鱼胚胎。这里描述的方法可以很容易地扩展到其他类别的聚糖,如含有唾液酸4 和 N -乙酰5,6的糖链,在发展中国家斑马鱼和其他生物可视化。
Protocol
1。蛋的收集和Dechorionation
- 收集和斑马鱼的卵转移到35mm培养皿中,删除尽可能多的水,然后添加1毫克/毫升Pronease在E3胚胎培养基E(5 mM氯化钠,0.17 mM的氯化钾,0.33毫米氯化钙2 · 2H 2 O,0.33毫米硫酸镁4,PH = 7.4),绒毛膜消化。
- 3-5分钟后,合并到一个烧杯中弥漫着鱼水(60毫克的“即时海洋”每公升蒸馏水H 2 O)的菜,轻轻的鸡蛋转移到烧杯中,并允许鸡蛋到入水“落“。
- 鱼水三次冲洗的鸡蛋。从他们的绒毛膜大部分的鸡蛋会被释放。
- 使用火抛光的玻璃巴斯德吸管,转让dechorionated鸡蛋琼脂糖涂层的培养皿菜肴充满E3胚胎中期。
2。显微注射与国内生产总值FucAl
- 以下报道的协议 7,准备注射菜。
- 转移到充满E3胚胎中期注射菜dechorionated鸡蛋。
- 准备针,2μL注射液和负载。该解决方案包含了20毫米的国内生产总值FucAl合成chemoenzymatically 8任的Alexa Fluor 594 -葡聚糖(5%W / V)作为示踪或酚红样染料(0.1%W / V)在0.2 mol氯化钾。作为阴性对照,与GDP -岩藻糖注射液取代国内生产总值FucAl。
- 打破了针,调整喷油压力和持续时间,产生了1 NL下降9。
- 注入1 NL的任何一个解决方案的鸡蛋。
- 转移到琼脂糖涂层培养皿充满E3胚胎中期的菜蛋。
- 在28 ° C孵育的鸡蛋和未受精的卵受精后三到四个小时内删除。
3。 BTTES - 铜(I)催化点击化学反应
- 当胚胎达到理想的发育阶段(如已故的原肠胚,组织分割和早期幼虫),外套一个96孔板,用琼脂糖基地。
- ,每孔加入92μLE3胚胎中期,随后另外4μL的Alexa Fluor 488叠氮(从一个2.5毫米的股票,在H 2 O),2μLBTTES,硫酸铜4 6:1复杂,和轻轻摇动混合。
- 点击化学试剂使用火抛光的玻璃巴斯德吸管转移到胚胎。每口井应包含少于五个胚胎。
- 添加2.5μL新鲜配制的抗坏血酸钠(100毫米股票在H 2 O)发起的点击反应 3 。终浓度为每一个试剂的Alexa Fluor 488叠氮:100微米; 硫酸铜 4:50微米; BTTES:300微米;抗坏血酸钠:2.5毫米。
- 3分钟后,加入2微升bathocuproine磺酸(H 2 O 50毫米股票),生物相容性铜螯合剂,然后立即稀释100μLE3胚胎中期淬火反应。
- 胚胎玻璃培养皿和清洗处理的胚胎与15毫升的E3胚胎中期的2倍。
4。成像
- MatTek玻璃底部的微孔盘上放置一个超低熔点琼脂糖(E3胚胎中期的1.2%(W / V))的下降,胚胎放入琼脂糖下降。
- 位置的胚胎背侧或外侧,并置于冰上5分钟,以巩固琼脂糖下降的菜。 E3胚胎培养基添加轻轻的菜,直到它涵盖了琼脂糖下降。
- 顺序使用共聚焦显微镜,荧光和明亮的现场图像采集。所有胚胎图像采集使用一个5微米的一步区间。综合数字准备使用ImageJ软件。
5。代表性的成果
图1显示了我们两个步骤的标签战略的工作流程。图2显示了斑马鱼的胚胎在受精后9.5小时(HPF)通过BTTES介导CuAAC标签。 BTTES是一个三(triazolylmethyl)胺为基础的配体。它加速CuAAC显着时在原位生成铜(一)协调,促进在生物系统中的环加成反应迅速没有明显的毒性。紧接着一个3分钟的点击反应,我们能够探测到强大的国内生产总值FucAl处理的胚胎标签(图2,左侧面板)。只有背景荧光检测控制胚胎显微注射与GDP -岩藻糖(图2中,右图)。
图1标签fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的包围层的战略。
图2。fucosylated聚糖通过BTTES铜(I)催化点击化学斑马鱼胚胎发育期间体内成像。单细胞阶段斑马鱼的胚胎显微注射单剂量的国内生产总值FucAl并允许发育运到9.5 HPF。胚胎的Alexa Fluor 488叠氮BTTES铜(一)催化反应。使用共聚焦显微镜成像反应胚胎。最大强度Z -投影图像的Alexa Fluor 488荧光(上图);明场(下图)。比例尺:100微米。
故障排除
问题 | 原因 | 补救 |
看不健康的胚胎 | 显微注射的溶液中含有污染物 | 核苷酸糖的纯度应大于85%。检查你的源代码。 |
没有标签后的反应 | 铜浓度低于30微米 | 要小心,不要稀释反应液加入过量E3胚胎培养基加入胚胎时,反应率显着下降,当铜浓度低于30微米的。 |
胚胎死亡后的反应 | 胚胎处理不当 | 确保吸管火抛光和反应容器涂一层非常薄的0.5%琼脂糖。 |
图像看起来参差不齐 | 所用试剂不正确混合后再加入胚胎 | 按照建议的顺序添加试剂,并确保点击化学试剂已正确之前加入胚胎混合。 |
图像显示,胚胎受损 | 剧烈摇晃的胚胎损害的反应过程中 | 一旦胚胎是在溶液中轻轻摇动少于10秒。 |
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Discussion
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是部分支持由美国国立卫生研究院(GM093282到十五分; 3U54AI057158 - 06S1到RDS)和艾伯特爱因斯坦医学院的启动资金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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