Quantificare i livelli di HIV-1 RNA nel plasma e sequenziamento singolo HIV-1 genomi di individui con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità (50-75 copie / ml) è difficile. Qui si descrive come estrarre e quantificare l'RNA virale plasmatico usando un test PCR in tempo reale che misura affidabile HIV-1 RNA fino a 0,3 copie / ml e come amplificare genomi virali mediante sequenziamento del genoma unico, da campioni con una carica virale molto bassa.
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Articolo metodologico
Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Amplificando i geni virali e la quantificazione di HIV-1 RNA di HIV-1 individui infetti con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità da test standard (sotto 50-75 copie / ml) è necessario per ottenere informazioni alla dinamica virale e le interazioni ospite del virus in pazienti che naturalmente controllare l'infezione e coloro che sono in terapia antiretrovirale combinata (CART).
Qui si descrivono come amplificare genomi virali da sequenziamento del genoma singolo (il protocollo SGS) 13, 19 e come quantificare con precisione HIV-1 RNA nei pazienti con bassa carica virale (la singola copia saggio (SCA) protocollo) 12, 20.
Il singolo-copia saggio è un real-time PCR con sensibilità a seconda del volume di plasma essere analizzati. Se un singolo genoma del virus viene rilevato in 7 ml di plasma, quindi il numero di copie di RNA è segnalato per essere 0,3 copie / ml. Il test è un test di controllo interno per l'efficienza di estrazione di RNA, e controlli per l'amplificazione del DNA o da possibili contaminazioni. I campioni dei pazienti sono misurati in triplice copia.
Il singolo test di sequenziamento del genoma (SGS), oggi largamente utilizzati e considerati non-lavoro intensivo 3, 7, 12, 14, 15, è un test di diluizione limite, in cui endpoint diluito prodotto cDNA si estende su una da 96 pozzetti piatto. Secondo una distribuzione di Poisson, quando meno di 1 / 3 dei pozzi danno prodotto, c'è una probabilità 80% della risultante prodotto di PCR è di amplificazione da una singola molecola di cDNA. SGS ha il vantaggio sulla clonazione di non essere sottoposto a ricampionamento e di non essere prevenuto mediante PCR-introdotto ricombinazione 19. Tuttavia, il successo di amplificazione di SCA e SGS dipendono dal disegno primer. Entrambi i saggi sono stati sviluppati per l'Hiv-1 sottotipo B, ma può essere adattato per altri sottotipi e in altre regioni del genoma di primer cambiando, sonde, e standard.
Protocollo
1. Estrazione di RNA da grandi volumi di plasma
Una panoramica dei test singola copia (SCA) e il singolo sequenziamento del genoma (SGS) protocollo sono forniti nelle figure 1 e 2.
- Per ottenere 7 ml di plasma, rotazione di circa 14 ml di sangue raccolte in 15 ml di EDTA (non eparina) tubi di raccolta a 2.600 xg per 15 minuti senza freni. Pipettare plasma (avendo cura di evitare lo strato del buffy coat) in provette da 15 ml.
- Se l'RNA è stato estratto per il saggio singola copia (SCA), punta il plasma con 30.000 copie del virione Virus Rous Sarcoma di controllo interno (RCA). Il virus RCA è pronto prima di eseguire SCA....
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Discussione
HIV-1 individui infetti in trattamento antiretrovirale combinata (CART) o che naturalmente controllare l'infezione hanno carica virale molto bassa, in genere circa 1 copia per ml di plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carica virale nei pazienti con controllo naturale, spesso oscillare intorno ad un singolo set di punto 1, 2, 17. La sensibilità del test è descritto nel presente documento dipende in larga misura il volume di ingresso di plasma. In generale, abbiamo lavorato con 7 ml di plasma, ma i risulta.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i pazienti che hanno partecipato a numerosi studi di HIV-1.
JMC era un professore di ricerca della American Cancer Society con il sostegno della Fondazione FM Kirby.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Esameri random (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman tampone A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U / ul) | Promega | N211B | |
| RT enzima (200 U / ul) | Strategene | 600107-51 | |
| AmpliTaq Gold DNA polimerasi | Applied Biosystems | 4311814 | 6-Pack |
| AmpliTaq 10XGold tampone PCR II | Applied Biosystems | 4311814 | viene fornito con l'enzima |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | viene fornito con l'enzima |
| 1M Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Apice III enzima trascrittasi inversa, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Apice III tampone 10X | Invitrogen | viene fornito con l'enzima | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | viene fornito con l'enzima | |
| Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | viene fornito con l'enzima |
| Proteinasi K-20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinio soluzione Tiocianato 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glicogeno 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanolo | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Etanolo al 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecolare acqua grado | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol ognuno) | Bioline | BIO-39025 |
| Nome del Euipment | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Facile Seal provette da centrifuga (16x73mm) | Seaton scientifico | 6041 | |
| Bianco Delrin corone | Seaton scientifico | 4020 | Tappi per le Tubi Seal Facile |
| Rack tubo per Optiseal Bell-Top Tubi, 8,9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex conducente ½ apertura inc | Seaton scientifico | 4013 | |
| Tappo rimozione TUPE | Seaton scientifico | 4014 | |
| 5 ml pipette sierologiche | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | qualsiasi | ||
| 15 ml di trasferimento pipette | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml di pipette di trasferimento Dispossable, punta fine | VWR | 14670-329 | |
| Provette da 15 ml per centrifuga | Falco | ||
| 1 ml centrifuga tubi | qualsiasi | ||
| Tampone Tris compresse Saline | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuga e rotore | Sorval | 90SE e T-1270 | |
| 96-PCR e piastre | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml di Reagente serbatoio | Costar | 4870 | |
| Microampere ottico 96-pozzetti di reazione | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Piatto ottico copre | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Pad compressione ottica | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealUn film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuga tubi | Qualsiasi | ||
| 1% gel di agarosio (E-gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA tubi di raccolta di qualsiasi marca
Riferimenti
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
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Ristampe e permessi
