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Summary

Questo articolo viene illustrato due metodi molto diversi di iniezione: 1) nel cervello (intracerebroventricolare) e 2) sistemica (endovenosa) per introdurre gli agenti terapeutici nel sistema nervoso centrale di topi neonati.

Abstract

Nonostante il ruolo protettivo che la barriera sanguigna del cervello gioca nella protezione del cervello, che limita l'accesso al sistema nervoso centrale (SNC), che il più delle volte si traduce in mancanza di terapie potenziali previsti per le malattie neurodegenerative ^1,2. Malattie neurodegenerative come l'atrofia muscolare spinale (SMA), in cui i neuroni motori inferiori sono interessati, possono trarre grandi vantaggi di introdurre gli agenti terapeutici nel sistema nervoso centrale. Lo scopo di questo video è quello di dimostrare due paradigmi diversi di iniezione per fornire materiali terapeutici in topo neonato subito dopo la nascita. Uno di questi metodi è l'iniezione direttamente nel cervello ventricoli laterali (intracerebroventricolare) che si traduce in consegna dei materiali nel sistema nervoso centrale attraverso il fluido cerebrospinale ^3,4. Il secondo metodo è una iniezione vena temporale (per via endovenosa) che possono introdurre terapie diverse nel sistema circolatorio, con conseguente consegna sistemiche tra cui il sistema nervoso centrale ^5. Trasduzione diffusa del sistema nervoso centrale è realizzabile se un vettore virale appropriato e sierotipo virale viene utilizzato. Visualizzazione e l'utilizzo della vena temporale per l'iniezione è possibile fino al giorno dopo la nascita 6. Tuttavia, se il materiale consegnato è destinato a raggiungere il sistema nervoso centrale, queste iniezioni dovrebbero avvenire mentre la barriera emato-encefalica è più permeabile per il suo status immaturi, preferibilmente prima del giorno post-natale 2. La pienamente sviluppato barriera emato-encefalica limita fortemente l'efficacia della consegna per via endovenosa. Entrambi i sistemi di consegna sono semplici ed efficaci, una volta l'attitudine chirurgica è raggiunto. Essi non richiedono dispositivi chirurgici ampio e può essere eseguita da una sola persona. Tuttavia, queste tecniche non sono senza sfide. Le piccole dimensioni dei post-natale giorno 2 cuccioli e le aree successive bersaglio di piccole dimensioni può rendere le iniezioni di difficile esecuzione e inizialmente difficili da replicare.

Protocol

1. Iniezione intracerebroventricolare

1. Il primo passo è la preparazione delle soluzioni madre l'iniezione; queste soluzioni sono vettore virale, DNA plasmidico, droghe, e deve essere iniettato in condizioni sterili.
2. Mescolare un titolo desiderato di vettore virale (5-7 totale mL) con il 0,05% w / v in PBS tripano blu per la visualizzazione del sito di iniezione.
3. Soluzione di DNA plasmidico (5 in totale l mL) contiene D-(+)-glucosio al 20% (w / v) (1 mL), trypan blu (0,05%) PBS (1 mL), il plasmide (~ 5 ~ g / L ~ ) (2 ~ L), e 2,5 kDa lineare PEI omopolimero (150 mm) (1 ~ L).
4. Immobilizzare il PND 2 neonati tramite crio-anestesia per 1-2 minuti.
5. L'ago utilizzato per questa iniezione è un micro-litro micropipetta tarata vetro sterilizzati che è collegato ad una siringa da 3 ml 3 ml Hamilton attraverso un lungo tubo.
6. Rompere la punta dell'ago (con spatola) per regolare la penetrazione per 2 mm nel cranio. Posizionare l'ago in diagonale nella provetta contenente la soluzione di iniezione. Caricare la soluzione iniezione l'ago con attenzione tirando lo stantuffo della siringa.
7. Dopo l'assorbimento della soluzione, dissociare la siringa dal tubo; tirare lo stantuffo fino ulteriormente e quindi collegare l'ago di nuovo.
8. Tenere l'ago nella mano destra tra il pollice e le dita indice e posizionare la siringa tra il medio e l'anulare con lo stantuffo toccando il palmo della mano destra.
9. Afferrare il topo immobilizzato con fermezza dalla pelle dietro la testa con la mano sinistra e posto su una fibra ottica la luce per illuminare le strutture anatomiche rilevanti che possono essere utilizzati come guida.
10. Inserire le 2 mm di profondità dell'ago, perpendicolare alla superficie del cranio, in una località a circa 0,25 mm lateralmente alla sutura sagittale e 0,50-0,75 millimetri anteriore del neonatali sutura coronarica (Figura 1A). Quindi, spingere lo stantuffo con il palmo della mano destra molto lentamente e con attenzione. Monitor per le navi rottura o gonfiore del viso.
11. Rimuovere l'ago 15 secondi dopo l'interruzione del movimento di stantuffo per impedire il riflusso.
12. Per recuperare, mantenere i topi per 5-10 minuti in un contenitore riscaldato fino a quando il movimento e la reattività generale viene ripristinato.

2. L'iniezione endovenosa attraverso la vena temporale / viso

1. La soluzione da iniettare deve essere preparata e integrata con filtrata colorante alimentare verde alla diluizione 1:100 e iniettato in condizioni sterili.
2. Allegare un piccolo plastico luer alla fine di una siringa di vetro 100 microlitri Hamilton. Per il luer, collegare un manometro 33 ago ipodermico 0,25 pollici. Assicurarsi che tutte le parti siano saldamente collegati.
3. Caricare la siringa con il volume da iniettare, assicurando che non ci sia aria nella siringa, come l'iniezione di aria nel vaso è letale. È spesso utile pipetta il volume da iniettare fino un pezzo di parafilm. Questo permette la visualizzazione chiara di assorbimento della soluzione nella siringa.
4. Un Transilluminatore Sight Wee è usato per visualizzare facilmente la vena temporale superficiale, o vena facciale, nel neonato (Figura 2A). Prima dell'iniezione, fissare il neonato al transilluminatore con nastro chirurgico. Garza deve essere collocato tra il neonato e il nastro per evitare che il nastro di danneggiare la pelle dell'animale. Fissare l'animale al transilluminatore dalla sua parte, assicurando che il nastro non impedisce la respirazione. Collo del neonato deve essere delicatamente girato in modo che la vena facciale è facilmente visibile e il naso dovrebbe essere registrato per stabilizzare la testa.
5. Utilizzando una lente d'ingrandimento 2.25X archetto per consentire la visualizzazione più semplice, inserire lentamente l'ago nella vena. La vena è molto superficiale modo che l'ago deve rimanere visibili sotto la pelle.
6. Infondere lentamente il volume di soluzione nella vena. La tinta verde permette una facile visualizzazione di iniezione.
7. Attendere 15 secondi prima di rimuovere l'ago in quanto vi è un ritardo tra completamente lo stantuffo della siringa e l'espulsione della soluzione rimanenti a causa del foro ago molto sottile.
8. Dopo aver rimosso l'ago, usare una garza per applicare pressione sul sito di iniezione fino a quando il sanguinamento cessa.
9. Monitorare il neonato per i segni di sofferenza. Dopo una iniezione appropriate, nessun disagio palese devono essere osservati. Il neonato deve essere somministrata circa 5 minuti per riprendersi prima di essere restituita alla gabbia.
10. Sciacquare l'ago / siringa unità con PBS tra iniezioni di sangue in l'ago si intasano rapidamente a causa di foro di piccole dimensioni.

3. Rappresentante dei risultati:

ICV iniezione: Il cervello può essere raccolte in diversi punti in tempo post-iniezione e visualizzati per dimostrare la tecnica di iniezione di successo. Se il colorante non viene aggiunto alla soluzione da iniettare, sarà difficile per verificare l'accuratezza del aproiezione. Iniezione appropriate di uno dei ventricoli permetterà la distribuzione del trypan blu sul lato del cervello iniettato circa 10-15 minuti dopo l'iniezione (Figura 1B). Una distribuzione uniforme di blu tripano in entrambi gli emisferi destro e sinistro cerebrale e bulbi olfattivi saranno visibili circa 60 minuti dopo l'iniezione (figura 1C). Ciò è dovuto alla connettività dei ventricoli cerebrali che permetterà la diffusione del colorante blu per il ventricolo adiacenti. Iniezioni accurato può anche essere visualizzati dalla dispersione del colorante blu nel rostrale canale centrale spinale circa entro 12 ore dopo l'iniezione (Figura 1D). Iniezioni inesatte si distingue per la mancanza di colore blu in emisferi cerebrali. In questo caso, la profondità dell'ago non era sufficiente e la soluzione di iniezione è probabilmente distribuito sotto la pelle. Una possibilità alternativa è che l'ago penetra troppo in profondità nel cervello, passando così al di là del ventricolo e la soluzione è svuotato sotto i ventricoli cerebrali.

IV iniezione: accurata ed efficiente iniezione vena temporale / facciali possono essere visualizzati immediatamente dopo l'iniezione. Dato che la soluzione viene iniettata, il colorante verde permette la visualizzazione della soluzione che entrano e che fluisce attraverso la vena facciale (Figura 2A). Inoltre, il colore della pelle alterata del mouse sarà osservato dopo l'iniezione. Colore normale rosa del neonato è convertito al verde, a causa della presenza di colorante alimentare verde nella soluzione da iniettare (Figura 2B). L'entità del cambiamento di colore verde osservato nel neonato dipende dalla concentrazione di colorante usato. Per la semplice visualizzazione di iniezione e durante un periodo di pratica, una diluizione 1:50 è raccomandato. Tuttavia, il tono della pelle drammaticamente alterato provoca spesso il cucciolo di essere rifiutato dalla madre e, quindi, la rimozione del colorante o di una concentrazione significativamente ridotto dovrebbero essere presi in considerazione durante le procedure sperimentali. Un'iniezione imprecisi comporterà l'accumulo di colorante verde sotto la pelle al sito di iniezione. Iniezione incompleta, che si verifica quando l'apertura dell'ago non è completamente inserito all'interno della vena, si vede quando qualche soluzione fluisce nella vena e alcuni si accumula sotto la pelle. Se questa è osservato, l'ago deve essere inserito ulteriormente nel vaso.

Figura 1. Dimostrazione del successo iniezioni ICV in PDN2 topi. A) Schema di iniezione utilizzati in iniezioni ICV nei ventricoli. B) Cervello da ICV iniettato Pup con tripano blu in PBS sul ventricolo sinistro, foto scattata 15 minuti dopo l'iniezione. C ) Cervello da ICV iniettato Pup con tripano blu in PBS a ventricolo sinistro, foto scattata 60 minuti dopo l'iniezione. D) viene mostrato rostrate centrale canale spinale in ICV iniettato cucciolo con tripano blu in PBS sul ventricolo sinistro, foto scattata 12 ore dopo l'iniezione.

Figura 2. Dimostrazione del successo iniezioni IV PDN2 topi. A) Schema di vena facciale utilizzata per iniezioni IV. B) Pup IV iniettato con colorante verde in PBS rispetto ai non-iniettati cucciolata, Foto scattata immediatamente dopo l'iniezione.

Discussion

La ricerca che utilizza modelli murini di malattie spesso richiede la somministrazione di farmaci o altre sostanze per neonati. In questo video, dimostriamo il passo per passo le procedure che coinvolgono due tipi di strategie di iniezione che possono essere utilizzati per indirizzare il sistema nervoso centrale: 1) iniezione diretta nel sistema nervoso centrale che utilizza intracerebroventricolare (ICV) di iniezione, oppure 2) intese a promuovere l'iniezione IV / temporali vena facciale. I tempi di queste iniezioni è di grande importanza. Dal momento che le iniezioni ICV sono a mano libera, il cranio deve essere relativamente malleabile. Questo tipo di iniezione è possibile solo attraverso la prima settimana di vita, e diventa sempre più difficile e dannosa per gli animali, come l'età degli animali. Tuttavia, il vantaggio principale è che la consegna diretta al SNC si ottiene, di fatto bypassando la barriera ematoencefalica. Pertanto, se un investigatore sta sviluppando terapie sistema nervoso centrale, è possibile analizzare i composti che non sono completamente ottimizzati per droga, come proprietà, come permeabilità della barriera emato-encefalica, tuttavia, l'attività composto può essere misurata in malattie rilevanti per i tessuti. L'uso della vena temporale durante i primi giorni di vita si è dimostrato prezioso come questo è una tecnica relativamente non invasiva per l'amministrazione generale IV. A questo stadio di sviluppo, non vene aggiuntivi sono facilmente accessibili, come ad esempio la vena della coda, che diventa più accessibile durante la seconda settimana di vita ^5. Entrambe le tecniche di iniezione sono sicuri e possono essere eseguiti a mano libera, con i topi recuperando subito dopo l'iniezione senza effetti collaterali dannosi. Entrambe le tecniche sono adatte per l'iniezione rapida di un gruppo di animali in un breve periodo di tempo. Essi richiedono la visualizzazione corretta del territorio mirati a garantire una iniezione di successo. Questo è fornito dalla transilluminatore e fascia d'ingrandimento in IV iniezione (Tabella 1) e una fibra ottica in luce l'iniezione ICV.

Uno dei vantaggi di iniezione endovenosa è che un volume maggiore (100 Ll ∞) possono essere iniettati con ~ tasso di successo del 90% ^6. Problemi comuni riscontrati durante l'apprendimento della tecnica IV comprendono smarrimento ago conseguente iniezioni sottocutanee e / o iniezioni incompleta. Questi problemi possono essere contrastata assicurando la smussatura dell'ago è accuratamente threaded attraverso il vaso. L'ago deve essere inserito nel vaso abbastanza lontano che la smussatura dell'ago è completamente circondata dalla nave. Inoltre, la nave è estremamente superficiale, in tal modo l'iniettore deve assicurarsi che l'ago è in vaso e non sotto di esso. Per verificare se l'ago è in vaso, dopo il posizionamento dell'ago dovrebbe essere leggermente spostato un lato all'altro. Se l'ago è penetrato la nave, la nave si sposta lungo con l'ago. Se la nave non si muove, l'ago non è inserito correttamente. L'esecuzione di questo controllo prima dell'iniezione aumenterà il numero di iniezioni di successo. Consegna neonatale di AAV9 vettori è stato recentemente utilizzato per trasdurre con successo una elevata percentuale di neuroni motori utilizzando vettori AAV ricombinante nei topi SMA ^7,8.

La considerazione più importante durante l'iniezione ICV coinvolge la lunghezza della punta dell'ago. La punta deve essere sufficientemente lungo in modo che possa penetrare almeno 2 mm nel cranio. Se la punta non è abbastanza lungo, l'ago non sarà in grado di entrare efficacemente nei ventricoli. In alternativa, se la punta è troppo lungo, questo ostacola l'assorbimento della soluzione da iniettare e crea anche una punta fragile che è difficile da guidare correttamente attraverso il cranio. L'angolo dell'ago è importante per garantire la penetrazione esatta nel ventricolo tenendolo perpendicolare al cranio con la punta verso la sutura sagittale. Iniezioni ICV sono stati utilizzati in numerosi studi di introdurre sostanze, droghe, RNA terapeutico, DNA plasmidi e vettori virali nel sistema nervoso centrale dei modelli di topi malati ^4,9-17. Tuttavia, il fattore limitante nella iniezione ICV è la capacità piccolo del ventricolo cerebrale nei topi neonati che potrebbero non permettere la penetrazione di un volume desiderato degli agenti terapeutici. Pertanto, la capacità di raggiungere livelli di espressione terapeutico utilizzando una dose inferiore vettore in un breve periodo di tempo è particolarmente importante in cui il volume di consegna è limitato.

Materials

Green Food Dye	McCormick & Co.	n/a	Must be filtered
Hamilton Glass Syringe (100 μL)	Sigma-Aldrich	20702
LuerMxF Thread Style White Nylon	Small Parts, Inc.	VPLF-LC78-1-25
Fine gauge Hypodermic Needles	Popper & Sons, Inc.	7111	Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM)
Wee Sight Transilluminator	Respironics	1017920
2.25X Headband Magnifier	MagEyes	Model No. 5	Select magnification to fit individual preferences