Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.
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Articolo metodologico
Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser
In questo articolo
Sommario
Abstract
Neuroni inibitori sono cruciali per la funzione corticale. Essi comprendono circa il 20% dell'intera popolazione neuronale corticale e può essere ulteriormente suddiviso in sottotipi diversi in base alle loro proprietà immunochimica, morfologiche, fisiologiche e 1-4. Sebbene precedenti ricerche hanno rivelato molto sulle proprietà intrinseche dei singoli tipi di neuroni inibitori, la conoscenza sulle loro connessioni circuito locale è ancora relativamente limitato 3,5,6. Dato che la funzione di ogni singolo neurone è plasmato da suo input eccitatori e inibitori sinaptica nei circuiti corticali, abbiamo usato scansione laser fotostimolazione (LSP) per le connessioni del circuito mappa locale a specifici tipi di cellule inibitorie. Rispetto alle tradizionali stimolazione elettrica o stimolazione sfoglia glutammato, LSP ha vantaggi unici consentendo la mappatura estesa e analisi quantitativa di locali funzionali alla ingressi individualmente registrato neuroni 3,7-9. Fotostimolazione laser tramite uncaging glutammato attiva selettivamente i neuroni perisomatically, senza attivare gli assoni di passaggio o dendriti distali, che assicura una risoluzione sub-laminare mappatura. La sensibilità e l'efficienza di LSP per gli ingressi mappatura da molti siti di stimolazione su una regione di grandi dimensioni sono adatte per l'analisi dei circuiti corticali.
Qui vi presentiamo la tecnica di LSP combinato con whole-cell patch di bloccaggio per la mappatura dei locali del circuito inibitorio. Registrazioni mirata di specifici tipi di cellule inibitorie sono facilitate con l'uso di topi transgenici che esprimono proteine verde fluorescente (GFP) in popolazioni limitate neuroni inibitori nella corteccia 3,10, che consente di campionamento coerente del tipi di cellule bersaglio e una chiara identificazione dei tipi di cellule registrato . Per quanto riguarda la mappatura LSP, delineiamo la strumentazione del sistema, descrivere la procedura sperimentale e acquisizione dati, e presentare esempi di mappatura circuito corteccia somatosensoriale primaria del mouse. Come illustrato nei nostri esperimenti, glutammato in gabbia si attiva in una regione nello spazio ristretto della fetta cervello fotolisi laser UV; simultanea voltage-clamp registrazioni consentono di individuare fotostimolazione evocati risposte sinaptica. Mappe di ingresso sia sinaptica eccitatoria o inibitoria al neurone bersaglio sono generati dalla scansione del fascio laser di stimolare centinaia di potenziali siti presinaptici. Così, LSP consente la costruzione di mappe dettagliate di ingressi sinaptici che influiscono su particolari tipi di neuroni inibitori attraverso esperimenti ripetuti. Nel loro insieme, la fotostimolazione tecnica basata neuroscienziati offre un potente strumento per determinare l'organizzazione funzionale dei locali dei circuiti corticali.
Protocollo
1. Cervello fetta preparazione
- Topi transgenici sono profondamente anestetizzati con sodio pentobarbital (> 100 mg / kg, ip) e rapidamente decapitati, ei loro cervelli estratti in una soluzione di taglio congelato e ossigenato.
- Occhiali GFP sono usati per lo screening visivo se il cervello di topo esprime davvero GFP.
- Sezioni della corteccia somatosensoriale primaria di 400 micron di spessore vengono tagliate con un vibratome in saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF). Fette vengono prima incubati in saccarosio-contenente ACSF per 30 minuti a 1 ora a 32 ° C, e dopo il periodo di incubazione iniziale, trasferito A....
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Discussione
Fotostimolazione a base di tecniche di mappatura sono state effettivamente applicate per l'analisi dei circuiti corticali. Fotostimolazione scansione laser combinato con registrazione cellula intera consente la mappatura ad alta risoluzione della distribuzione laminare di sorgenti di ingresso presinaptico di singoli neuroni, in quanto la registrazione simultanea da un neurone postsinaptico with fotostimolazione di cluster di neuroni presinaptici in molti luoghi diversi fornisce misure quantitative della distribuzion.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of concede Salute DA023700 e DA023700-04S1 al XX
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| topo transgenico linee | Jackson laboratorio o altre fonti | Si prega di fare riferimento a Xu e Callaway (2009) | |
| GFP occhiali | BLS Ltd., Ungheria | ||
| vibratome | Leica Sistemi | VT1200S | |
| MNI glutammato in gabbia (4-metossi-7-nitroindolinyl gabbia-l-glutammato) | Bioscience Tocris, Ellisville, MO | Cat. No. 1490 | |
| biocitina | B4261 | ||
| elettrodo estrattore | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| tubi di vetro per fare elettrodi | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp amplificatore 700B | I dispositivi molecolari, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| fotocamera digitale CCD | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Ricerca microscopio | Olympus, Tokyo, Giappone | BW51X | |
| UV laser dell'unità | I laser DPSS, Santa Clara, CA | modello 3501 | |
| Altre attrezzature per phostimulation scansione laser | Si prega di fare riferimento a Xu et al (2010). |
Soluzioni:
- Saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per il taglio fetta (in mm: 85 NaCl, 75 saccarosio, 2.5 KCl, 25 di glucosio, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, e 24 NaHCO 3).
- Registrazione ACSF (in mm: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, e 10 di glucosio)
- Elettrodo soluzione interna (in mm: 126 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, e 10 fosfocreatina, pH 7,2, 300 mOsm).
Riferimenti
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, ....
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Ristampe e permessi
