Summary
A pesar de los recientes avances en la modificación genética, la transfección de células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) sigue siendo un proceso caprichoso. Para nuestro conocimiento, los métodos sistemático y eficiente para transfectar las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) no se han reportado. Aquí se describen los protocolos robustos para transfectar eficiente y nucleofect CMPi humanos.
Abstract
La modificación genética es continuar siendo una herramienta esencial en el estudio de la biología de células madre y en el planteamiento de las posibles aplicaciones clínicas de las células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) 1. Mientras que las mejoras en varios métodos de entrega de genes se han descrito 2.9, sigue siendo un proceso de transfección de células madre embrionarias humanas caprichosa, y aún no ha sido reportado en humanos células madre pluripotentes inducidas (CMPi). En este video, que demuestran cómo nuestro laboratorio de rutina y transfecta nucleofects CMPi humanos utilizando el plásmido con un aumento de proteína verde fluorescente (eGFP) periodista. CMPi humanos se adaptan y se mantiene como alimentador de cultivos libres para eliminar la posibilidad de la transfección de células de alimentación y para permitir la selección eficiente de los clones transgénicos estable iPSC después de transfección. Para nucleofection, CMPi humanos son pre-tratados con inhibidores de rock 11 de tripsina en pequeños grupos de células, y nucleofected replated en los alimentadores en el alimentador de la célula-medio condicionado para mejorar la recuperación celular. Transgenes que expresan CMPi humanos se pueden obtener después de 6 horas. Selección del antibiótico se aplica después de 24 horas y de líneas transgénicas estables aparecen dentro de una semana. El protocolo es robusto y reproducible de líneas de iPSC sin alterar la pluripotencia de estas células.
Protocol
Nuestro protocolo se inicia con un método de adaptación CMPi humanos para liberar a las culturas de alimentación, seguido por los protocolos para la transfección CMPi humanos utilizando GeneJuice (EMD) y nucleofection de CMPi humano utilizando un dispositivo nuclefector Amaxa.
Nota: Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en una campana de flujo laminar estéril. Todos los medios de comunicación y soluciones equilibradas a 37 ° C de temperatura ambiente antes de comenzar o menos que se especifique lo contrario.
1. El establecimiento de CMPi humanos en el alimentador sin sistema
CMPi humanos previamente mantenido en las células de alimentación se puede dividir, transferido a Geltrex recubiertos plato y se mantiene durante dos pasajes antes de la alimentación libre de transfección.
- Descongele Geltrex la noche a 4 ° C. Para preparar el recubrimiento Geltrex, diluir descongelado Geltrex 1:50 en DMEM frío. Mezclar suavemente las soluciones.
Nota: Geltrex, como Matrigel es una forma soluble de la matriz de la membrana basal purificada a partir de células murinas Engelbreth-Holm-Swarm tumor (EHS). Por otra parte, Matrigel se puede utilizar como una matriz extracelular para establecer alimentador de cultivos libres de iPSC humanas.
- Cubrir toda la superficie de los pozos de la cultura con Geltrex solución (1 ml de una de 35 mm también). Escudo pozos con Geltrex a 37 ° C incubadora durante 1 hora.
- Para CMPi paso humano, añadir 1 ml de accutase por pocillo y se incuba a 37 ° C durante 1 minuto hasta que la mayoría de las células comienzan a separarse.
Para CMPi paso humano, añadir 1 ml de accutase por pocillo y se incuba a 37 ° C durante 1 minuto hasta que la mayoría de las células comienzan a separarse.
- Añadir 10-15 perlas de vidrio a las células y agite suavemente la placa. Añadir 2 ml de golpe de gracia DMEM / F12 y triturar con suavidad. Transferencia de suspensión de células a un tubo de centrífuga de 10 ml.
- Girar las células a 800 rpm durante 3 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante del tubo, dejando humanos pellet iPSC intacto. Agitar suavemente el tubo para dispersar sedimento celular.
- Quitar Geltrex del pozo cubierto.
- Resuspenda suavemente humanos pellet de IPSC en un volumen adecuado de STEMPRO. Distribuir entre los pozos de los alimentadores, en función de la tasa de proliferación). CMPi humano puede pasarse de una relación de división de 1:2 a 1:6.
- Con cuidado, coloque en 5% de CO 2 incubadora, agitar la placa con cuidado para asegurar una distribución uniforme de las células a través de los pozos.
- Alimentación de las celdas al día hasta que las células están listos para ser dividido de nuevo (cuando las células alcanzan el 80% de confluencia).
- Paso a nuevas humanos CMPi Geltrex recubierto así (paso 1.3 a 1.9) en una relación de división de 1:2. Pequeñas colonias deben ser formados y distribuidos de manera uniforme en Geltrex recubiertos bien antes de la transfección.
2. Transfección de CMPi humanos con GeneJuice
Las células (cultivadas en placas de 6 pocillos) debe ser de aproximadamente 40 a 50% confluentes en el día de la transfección de lograr la eficacia de transfección óptima. No es necesario cambiar el medio celular hasta el día siguiente.
- Preparar 100 KO-DMEM/F12 l en un tubo estéril eppendorf de 1,5 ml. Añadir 27 l de reactivo de transfección GeneJuice. Mezclar bien. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Añadir 4 g de ADN plásmido. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos. La elección de los plásmidos es fundamental para la óptima eficiencia de transfección. Nosotros usamos un plásmido con una proteína de fluorescencia verde mayor (eGFP) impulsado por el promotor CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG promotor es un promotor fuerte que es transcripcionalmente activo en CMPi humanos y por lo tanto se puede utilizar para conducir la expresión del transgén en las células. En nuestras manos, linearización del plásmido no parece afectar a la eficacia de transfección.
- Añadir GeneJuice mezcla de ADN a las células y agitar la placa. Haga girar la placa a 1200 rpm durante 5 minutos (método "spinoculation ') para aumentar el contacto de la mezcla de transfección con CMPi humanos en el pozo.
- Se incuban las células a 37 ° C durante la noche.
- Monitorear la eficiencia de transfección al día siguiente.
- Para la transfección estable, el cambio medio al día siguiente con nuevas STEMPRO. Añadir la selección adecuada de antibióticos después de 24 a 48 horas.
3. Nucleofection de CMPi humanos
CMPi humanos que han crecido en los alimentadores o Geltrex se puede utilizar para nucleofection. Sin embargo, se recomienda replating nucleofected CMPi humanos en fibroblastos de embriones de ratón (MEF) o fibroblastos de prepucio humano (HFF) alimentadores para garantizar la viabilidad celular alta y la recuperación. Por lo menos 2 millones de células se debe utilizar para lograr una mayor supervivencia celular tras nucleofection.
- Prepare la célula de enlace de medios condicionados (CM) por el golpe de gracia iPSC incubando suero humano de reemplazo (KOSR) los medios de comunicación con las células de alimentación durante la noche. CM recoger cada 24 horas.
Nota: Cualquier cepa de ratón utilizada para la preparación de las capas de alimentación (como BLK6, CF1 y MF1) es adecuado para ser utilizado parar lo que CM.
- En el día de nucleofection, pre-tratamiento CMPi humanos con 10 inhibidor de rock M durante al menos 1 hora.
- Preparar 82 l de solución de nucleofector humanos con células madre en un tubo estéril eppendorf de 1,5 ml. Añadir 18 l suplemento 1. Mezclar bien. Incubar la solución a 37 ° C durante 5 minutos.
- Pre-caliente de alimentación de células acondicionado medios de comunicación (CM) y el 0,25% de tripsina / EDTA a 37 º C. Bajo el capó, prelabel una estéril tubo cónico de 15 ml.
- Retire con cuidado los medios de comunicación de la cultura humana que se iPSC nucleofected. Lave suavemente las células con 2 ml de solución de fosfato buffer 1X (PBS) por pocillo. Aspirar el PBS. Añadir 1 ml de tripsina 0,25% por pozo. Se incuban las células a 37 ° C durante 3 minutos.
- Triturar suavemente las células con 1000 ml punta de la pipeta. Lave la parte inferior del pozo para asegurarse de que todos los CMPi humanos son completamente separados. Transferencia de suspensión de células en el tubo de 15 ml etiquetados cónica.
Nota: tripsina en células individuales deben ser estrictamente evitados. Las células sólo se debe desplazarse en pequeños grupos de células contaba con aproximadamente trillizos de las células. Pequeños grupos de células (células triples) se disocia en células individuales durante la posterior manipulación de las células.
- Añadir 9 ml MEF medios para inactivar la tripsina. Girar las células a 800 rpm durante 3 minutos. Con cuidado aspirar el sobrenadante y dejar el pellet de células intactas.
- Resuspender las células en precalentado 100 l de solución de nucleofector humanos con células madre a partir del paso 3.3.
- La transferencia de las células a una cubeta nucleofector con un 1 ml punta de la pipeta.
- Añadir 4 g de ADN plásmido en la suspensión celular en la cubeta. Las células y el ADN mezcla agitando lentamente. Toque en la cubeta dos veces en la superficie de la campana.
- Insertar la cubeta en el soporte nucleofector. Utilice los programas de B-016. Células Nucleofect pulsando el botón X.
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- Recuperar las células nucleofected de la cubeta utilizando para ello la pipeta Pasteur de plástico. Recuperar las células de la resuspensión en CM precalentado y el inhibidor de piedra en un tubo estéril eppendorf de 1,5 ml. Las células se incuban a 37 ° C durante 10 minutos para permitir que las células se recuperan.
- Transferencia de sabios de abandono en las capas de alimentación utilizando una punta de la pipeta ml células. Se incuban las células a 37 ° C durante la noche.
- Monitorear la eficiencia de transfección al día siguiente. Para obtener clones estables de transgénicos CMPi humanos que expresan establemente transgén, el cambio medio al día siguiente con CM y el inhibidor de ROCK. Añadir la selección adecuada de antibióticos después de 24 a 48 horas.
4. Los resultados representativos:
Figura 1. Microfotografías de Riv1 CMPi humanos transfectadas con pCAG-eGFP. (A) eGFP que expresan las células transfectadas con Riv1 GeneJuice en Geltrex 12 horas después de la transfección. Las colonias de Riv1 CMPi humanos plateado y formado en los alimentadores siguientes nucleofection utilizando B-016 (B) y A-023 (C) del programa. (D) de forma estable eGFP que expresan humanos colonias iPSC con expresión eGFP omnipresente derivados de GeneJuice. (E) establemente transfectadas Riv1 CMPi humanos retenidos eGFP expresión constitutiva en la diferenciación del cuerpo embrioides.
Discussion
Nuestros protocolos de resultado en las técnicas de simple, robusto y altamente reproducible para introducir transgenes en CMPi humanos sin efectos tóxicos importantes y la muerte celular. CMPi humanos deben ser pasados en pequeños grupos de células (células 5-10) y se colocaron en Geltrex en alta densidad (1:2) para asegurar la eficacia de transfección óptima en numerosas colonias pequeñas. De líneas de iPSC que son más propensos a la muerte celular y la diferenciación, mayor número de CMPi humanos (hasta 4 X 10 6 células) debe ser utilizado para un experimento de nucleofection sola. Ensayo de transfección transitoria genera un gran número de transgenes que expresan CMPi humanos dentro de un día. Transfectadas establemente clones iPSC suelen aparecer dentro de 7 días, y estas colonias transgénicos deben estar listos para ser recogidos dentro de tres semanas. El uso del promotor CAG se describe aquí se asegura la expresión en todas partes del reportero eGFP. En virtud de estas mejoras, los protocolos pueden ser alimentados en otras aplicaciones, incluyendo la sobreexpresión de inducción condicional, la derivación de líneas reportero linaje específico, caída del shRNA o siRNA, la orientación de genes y la recombinación homóloga.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Trabajo que se describe en este manuscrito fue posible gracias a la financiación del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) para Core UCR de células madre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
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