Summary
Trots den senaste tidens framsteg inom genetisk modifiering förblir transfektion av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) en nyckfull process. Såvitt vi vet har systematiska och effektiva metoder för att transfektera humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) inte rapporterats. Här beskriver vi robusta protokoll för att effektivt transfektera och nucleofect mänskliga iPSCs.
Abstract
Genetisk modifiering fortsätter att vara ett viktigt verktyg för att studera biologi stamceller och som anger potentiella kliniska tillämpningar av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) 1. Medan förbättringar i flera metoder gentillförsel har beskrivits 2-9, förblir transfektion en nyckfull process för hESCs, och har ännu inte rapporterats i humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). I den här videon visar vi hur vårt laboratorium rutinmässigt transfects och nucleofects mänskliga iPSCs med plasmid med en förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) reporter. Mänskliga iPSCs anpassas och behållas som feeder-fria kulturer för att eliminera möjligheten av feeder-cell transfektion och att möjliggöra en effektiv selektion av stabila transgena IPSC kloner efter transfektion. För nucleofection, mänskliga iPSCs förbehandlas med rock-hämmare 11, trypsiniserades i små klumpar av celler, nucleofected och återutströks på matare i matare cell-konditioneratmedium för att öka cell återhämtning. Transgen-uttryckande humana iPSCs kan erhållas efter 6 timmar. Antibiotikaselektion appliceras efter 24 timmar och stabila transgena linjer visas inom 1 vecka. Vår protokoll är robust och reproducerbar för mänskliga IPSC linjer utan att ändra pluripotens av dessa celler.
Protocol
Vår protokoll börjar med en metod för att anpassa människor iPSCs till feeder-fria odlingar, följt av protokoll för transfektion mänskliga iPSCs med GeneJuice (EMD) och nucleofection av mänskliga iPSCs med hjälp av en AMAXA nuclefector enhet.
Anmärkning: Följande procedurer utförs i en steril laminärt flöde huva. Alla medier och lösningar bringas till jämvikt vid 37 ° C eller rumstemperatur innan om inget annat anges.
1. Etablera mänsklig iPSCs på feeder-system utan
Mänskliga iPSCs tidigare underhålls på matarceller kan delas, överförs till Geltrex-belagd skål och upprätthölls under två passager innan feeder-fri transfektion.
- Tina Geltrex natten vid 4 ° C. För att framställa Geltrex beläggning, utspädd tinas Geltrex 1:50 i kall DMEM. Blanda lösningarna försiktigt.
Notera: Geltrex, som Matrigel är en löslig form av basalmembran matrix renade från murin Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumörceller. Alternativt kan Matrigel användas som en extracellulär matris för att fastställa feeder-fria humana IPSC kulturer.
- Täck hela ytan odlingsbrunnar med Geltrex lösning (1 ml för en 35-mm brunn). Coat brunnar med Geltrex vid 37 ° C inkubator under 1 timme.
- Passage mänskliga iPSCs, tillsätt 1 ml Accutase per brunn och inkubera vid 37 ° C under 1 min tills de flesta celler börjar lossna.
Passage mänskliga iPSCs, tillsätt 1 ml Accutase per brunn och inkubera vid 37 ° C under 1 min tills de flesta celler börjar lossna.
- Lägg 10-15 glaspärlor till cellerna och snurra försiktigt plattan. Tillsätt 2 ml Knockout DMEM / F12 och försiktigt finfördela. Överför cellsuspensionen till en 10 ml centrifugrör.
- Spin celler vid 800 rpm under 3 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten från röret, vilket humant IPSC pelleten intakt. Knacka försiktigt rör tilldispergera cellpelleten.
- Ta Geltrex från den belagda bra.
- Försiktigt resuspendera humant IPSC pelleten i en lämplig volym av STEMPRO. Fördela mellan brunnar i matare, beroende på proliferationshastigheten). Mänskliga iPSCs kan passera i en delad förhållande på 1:2 till 1:6.
- Försiktigt plats i 5% CO-2-inkubator, virvel plattan noga för att säkerställa en jämn fördelning av celler över brunnarna.
- Feed celler dagligen tills cellerna är redo att delas igen (när celler når 80% konfluens).
- Passage mänskliga iPSCs på nya Geltrex-belagd väl (steg från 1,3 till 1,9) i en delad förhållande 1:2. Små kolonier bör bildas och fördelas jämnt på Geltrex-belagd brunn före transfektion.
2. Transfektion av humana iPSCs med GeneJuice
Celler (odlade på 6-brunnsplattor) bör vara ca 40 -50% sammanflytande på dagen för transfektion för att uppnå optimal transfektionseffektivitet. Det ärinte nödvändigt att ändra cellmediet förrän nästa dag.
- Bered 100 pl KO-DMEM/F12 i en steril 1,5 ml eppendorf-rör. Lägg 27 pl reagens GeneJuice transfektion. Blanda väl. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Tillsätt 4 | ig plasmid-DNA. Inkubera röret vid rumstemperatur under 15 minuter. Valet av plasmiden är kritisk för optimal transfektionseffektivitet. Vi använder en plasmid med en förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) som drivs av CAG promotor 5 (pCAG-EGFP). CAG promotor är en stark promotor som är transkriptionellt aktiv i humana iPSCs och kan sålunda användas för att driva transgen expression i dessa celler. I våra händer hade linearisering av plasmid tycks inte påverka transfektionseffektivitet.
- Lägg GeneJuice-DNA-blandningen till celler och snurra på plattan. Snurra plattan vid 1200 rpm under 5 minuter ('spinoculation' metod) för att öka kontakten för transfektion blandning med humana iPSCs på brunnen.
- Inkubera cellerna vid 37 &grader, C över natten.
- Övervaka transfektionseffektivitet nästa dag.
- För stabil transfektion, ändra medium nästa dag med färska STEMPRO. Lägg lämplig antibiotikabehandling val efter 24 till 48 timmar.
3. Nucleofection mänskliga iPSCs
Mänskliga iPSCs odlas på matare och Geltrex kan användas för nucleofection. Vi rekommenderar dock starkt replating nucleofected mänskliga iPSCs på mus embryonala fibroblast (MEF) eller humant förhudsfibroblast (HFF) matare för att säkerställa hög cellviabilitet och återhämtning. Minst 2 miljoner celler bör användas för att uppnå högre cellöverlevnad efter nucleofection.
- Förbered feeder-cell konditionerade media (CM) genom att inkubera humana IPSC Knockout Serum Replacement (KOSR) media med matarceller natten. Samla CM var 24 timmar.
Obs: Alla musstam används för framställning av feeder lager (t.ex. BLK6, CF1 och MF1) är lämplig att användas föR gör CM.
- På dagen för nucleofection, förbehandla humana iPSCs med 10 iM ROCK inhibitor för minst 1 timme.
- Bered 82 il mänskliga stamceller nucleofector lösning i en steril 1,5 ml eppendorf-rör. Lägg 18 ul tillägg 1. Blanda väl. Inkubera lösningen vid 37 ° C under 5 min.
- Pre-varm feeder-cell-konditionerat medium (CM) och 0,25% trypsin / EDTA till 37 ° C. Under huven, prelabel en steril 15 ml koniskt rör.
- Ta försiktigt bort media från människa IPSC kultur att nucleofected. Försiktigt tvätta cellerna med 2 ml 1X fosfatbuffrad lösning (PBS) per brunn. Aspirera PBS. Tillsätt 1 ml av 0,25% trypsin per brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C under 3 minuter.
- Försiktigt triturera cellerna med 1000 ml pipettspets. Tvätta botten av brunnen för att se alla mänskliga iPSCs helt fristående. Överför cellsuspensionen till den märkta 15 ml koniska rör.
Obs: trypsinisering till enda Calnar bör strikt undvikas. Cellerna bör endast rubbas i små klumpar av celler bestod av cirka tripletter av celler. Små klumpar av celler (cell tripplar) blir dissocieras till enskilda celler under den efterföljande hanteringen av cellerna.
- Lägg 9 ml MEF medium för att inaktivera trypsin. Spin celler vid 800 rpm under 3 minuter. Försiktigt aspirera supernatanten och lämna cellpelleten intakt.
- Resuspendera celler i förvärmd 100 ul mänskliga stamceller nucleofector lösningen från steg 3,3.
- Överför celler till en nucleofector kyvett med användning av en 1 ml pipettspets.
- Tillsätt 4 | ig av plasmid-DNA in i cellsuspensionen i kyvetten. Blanda celler och DNA genom att försiktigt snurra. Tryck på kyvetten två gånger på motorhuven yta.
- Sätt kyvetten i nucleofector hållaren. Använd program B-016. Nucleofect celler genom att trycka på knappen X.
<
- Hämta nucleofected celler från kyvetten med den medföljande Pasteur plastpipett. Återskapa celler genom att återsuspendera dem i förvärmd CM och ROCK hämmare i en steril 1,5 ml Eppendorf-rör. Inkubera cellerna vid 37 ° C under 10 minuter för att låta celler återhämta sig.
- Överför celler droppvis på feeder lager med 1 ml pipettspets. Inkubera cellerna vid 37 ° C över natten.
- Övervaka transfektionseffektivitet nästa dag. För att härleda stabila kloner av transgena människor iPSCs som stabilt uttrycker transgen, ändra medium nästa dag med CM och ROCK hämmare. Lägg lämplig antibiotikabehandling val efter 24 till 48 timmar.
4. Representativa resultat:
Discussion
Våra protokoll resulterar i enkla, robusta och mycket reproducerbara metoder för att införa transgener i mänskliga iPSCs utan framträdande toxisk effekt och celldöd. Mänskliga iPSCs bör passeras i mindre klumpar av celler (5-10 celler) och utströks på Geltrex vid hög densitet (1:2) för att säkerställa optimal transfektionseffektivitet i många små kolonier. För mänskliga IPSC linjer som är mer benägna att differentiering och celldöd, bör större antal människor iPSCs (upp till 4 x 10 6 celler) användas för en enda nucleofection experiment. Övergående transfektionsanalys genererar stora mängder transgena-uttryckande humana iPSCs inom 1 dag. Stabilt transfekterade IPSC kloner debuterar vanligen inom 7 dagar, och dessa transgena kolonier bör vara redo att plockas inom tre veckor. Användningen av CAG promotor som beskrivs här ger allmänt förekommande uttryck för EGFP reporter. Under sådana förbättringar kan våra protokoll matas in i andra tillämpningar, inklusive överuttryck, cillkorad induktion, härledning av härkomst-specifika reporter linjer, shRNA eller siRNA knockdown, riktad genmodifiering och homolog rekombination.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet beskrivs i detta manuskript har gjorts möjlig genom bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) för UCR Stem Cell Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
