Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

Sommario

Un metodo per la stima della costante di affinità di un agonista per lo stato attivo ( K _{B) Di una proteina-recettore accoppiato G è descritto. L'analisi fornisce misure assoluto o relativo di K B A seconda che l'attivazione del recettore costitutivo è misurabile. Il nostro metodo si applica a diverse risposte a valle da attivazione del recettore.}

Abstract

Quando un agonista attiva una popolazione di G recettori accoppiati alla proteina (GPCR), suscita una via di segnalazione che culmina nella risposta della cellula o tessuto. Questo processo può essere analizzato a livello di un solo recettore, una popolazione di recettori, o una risposta a valle. Qui descriviamo come analizzare la risposta a valle di ottenere una stima della costante di affinità agonista per lo stato attivo di singoli recettori.

Recettori si comportano come interruttori quantica che si alternano tra gli stati attivi e inattivi (Figura 1). Lo stato attivo interagisce con le proteine ​​G specifiche o altri partner di segnalazione. In assenza di ligandi, lo stato inattivo predomina. Il legame di agonista aumenta la probabilità che il recettore passerà nello stato attivo, perché la sua affinità costante per lo stato attivo (K _b) è molto maggiore di quella per lo stato inattivo (K _a). La somma deiuscite casuale di tutti i recettori della popolazione produce un costante livello di attivazione dei recettori nel tempo. Il reciproco della concentrazione di agonista suscitando mezza massimo l'attivazione del recettore è equivalente alla costante osservato affinità (K _obs), e la frazione di agonista dei recettori complessi nello stato attivo è definita come efficacia (ε) (Figura 2).

Metodi per l'analisi delle risposte a valle di GPCR sono stati sviluppati che permettono la stima della K _oss e l'efficacia relativa di un ^1,2 agonista. In questo rapporto, si mostra come modificare questa analisi per stimare il valore agonista K _b rispetto a quello di un altro agonista. Per i saggi che mostrano l'attività costitutiva, mostriamo come stimare K _b in unità assolute di M ^-1.

Il nostro metodo di analisi agonista curve concentrazione-risposta ^3,4 è costituitoglobale di regressione lineare utilizzando il modello operativo ^5. Abbiamo descritto una procedura utilizzando l'applicazione software, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). L'analisi produce una stima del prodotto di K _obs e un parametro proporzionale alla efficacia (τ). La stima del τK _obs di un agonista, divise da quella di un altro, è una misura relativa di K _b (RA _i) ^6. Per qualsiasi attività costitutiva del recettore espositrici, è possibile stimare un parametro proporzionale alla efficacia del complesso recettore libero (τ _sys). In questo caso, il valore K _b di un agonista è equivalente a τK _obs / τ _sistema ^3.

Il nostro metodo è utile per valutare la selettività di un agonista per i sottotipi del recettore per la quantificazione e agonista dei recettori segnalazione attraverso diverse proteine ​​G.

Protocollo

1. Misura della agonista curve concentrazione-risposta: nessuna attività costitutiva

1. Per la stima dei relativi valori agonista K _b (RA _i), una serie di almeno due agonista curve concentrazione-risposta è necessaria. Qualsiasi test in vitro per la risposta funzionale di un GPCR può essere misurata a condizione che la concentrazione di agonista può essere controllato e un solo tipo di recettore della risposta media. Adatto saggi cellulari includono la misurazione del cAMP ^4,7 e l'accumulo inositolphosphate ^8,9 in una linea cellulare che esprime un recettore ricombinante. Esempi di analisi del tess....

Discussione

Perché il nostro metodo per la stima RA _i (relativo valore di K _b) richiede solo la misura della agonista curve concentrazione-risposta, la nostra analisi può essere fatta in qualsiasi momento queste curve sono misurate.

Se il giorno per giorno variazione della risposta della preparazione sperimentale (ad esempio, cellule o tessuti) è di grandi dimensioni, le misure di risposta di ogni curva concentrazione-risposta possono essere normalizzati rispetto al preven.......