Summary
Het ontwerp van een eenvoudige een-dag workflow regeling voor bacteriële pathogenen diagnostiek maakt het mogelijk snelle herkenning van infecties in het bloed. Het opnemen van acht klinisch relevante bacteriële doelen en de resistentie tegen antibiotica profielen biedt de arts een eerste inzicht op dezelfde dag, wat kan leiden tot meer adequate therapie.
Abstract
Infecties in het bloed gepaard gaan met hoge sterftecijfers als gevolg van de waarschijnlijke manifestatie van sepsis, ernstige sepsis en septische shock 1. Daarom snelle toediening van antibiotica voldoende is van het grootste belang bij de behandeling van infecties in het bloed. De kritische element in dit proces is de timing, sterk afhankelijk van de resultaten van bacteriële identificatie en antibiotische gevoeligheid testen. Beide parameters worden routinematig, verkregen door gebaseerde tests die tijdrovend en neemt gemiddeld 24-48 uur 2, 4. Het doel van de studie was om DNA-gebaseerde testen voor de snelle identificatie van infecties in het bloed, evenals een snelle antimicrobiële gevoeligheid testen te ontwikkelen. De eerste test is een eubacteriële 16S rDNA-gebaseerde real-time PCR-test aangevuld met soort-en genus-specifieke probes 5. Met behulp van deze probes, Gram-negatieve bacteriën waaronder Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaen Escherichia coli en Gram-positieve bacteriën zoals Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. Streptococcus spp. en Streptococcus pneumoniae te onderscheiden. Met deze assay Multiprobe is een eerste identificatie van de veroorzakende micro-organismen die na 2 h.
Tweede we een semi-moleculaire assay voor antibiotica gevoeligheidstests S. aureus, Enterococcus spp. en (facultatieve) aërobe Gram-negatieve staven 6. Deze test is gebaseerd op een onderzoek waarin PCR werd gebruikt om de groei van bacteriën 7 meten. Bacteriën direct geoogst van bloedkweken worden gedurende 6 uur met een selectie van antibiotica, en na een SYBR Green-gebaseerde real-time PCR-test bepaalt de remming van de groei. De combinatie van deze twee methoden kunnen direct de keuze van een geschikte antibiotische therapie op dezelfde dag (figuur 1). Tenslotte, Moleculaire analyse van zowel identificatie en antibiotica gevoeligheid biedt een sneller alternatief voor het opsporen van ziekteverwekkers en kan de diagnose van infecties in het bloed.
Protocol
DEEL I: PATHOGENEN IDENTIFICATIE
1. Monstervoorbereiding
Opmerking: De hele moleculaire workflow zoals beschreven in het protocol moet worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor kwaliteitsborging in de moleculaire diagnostiek 3.
- Voeg een 0,1 ml van bloedkweek tot 0,9 ml 0,9% NaCl in een 1,5 ml reactie buis aan een 1:10 verdunde monster te worden. (Verdun om qPCR remming te voorkomen).
- Centrifugeer monster op 13400 xg gedurende 5 minuten tot pellet de bacteriële DNA.
- Resuspendeer de bacteriële pellet in 100 ui steriel gedemineraliseerd H 2 O.
- Bewaar het DNA-monster bij 4 ° C tot gebruik.
2. Identificatie Assay: Real-time 16s rDNA PCR
- Bereid de reactiemengsels als volgt. De test bestaat uit vier afzonderlijke reacties per monster. Elk mengsel bevat 12,50 ul meestermix, 0,9 pM voorwaartse primer (5 TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7 0,6 uM reverse primer (5 GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 en een panel van probes. De hoeveelheid probes voor elk van de vier afzonderlijke reacties hieronder.
- De eerste reactie omvat:
- 0,2 uM universele sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0,2 uM P. aeruginosa probe (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- De tweede reactie omvat:
- 0,2 uM E. coli probe (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 uM Pseudomonas spp. probe (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- De derde reactie omvat:
- 0,2 uM Staphylococcus spp. probe (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0,2 uM S. aureus probe (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- De vierde reactie omvat:
- 0,2 uM universele sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 uM Streptococcus spp. probe (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0,2 uM S. pneumoniae probe (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Voeg steriele gedeïoniseerd H2O tot een totaal volume van 20 pl te bereiken. Voeg 20 pl van elke reactiemengsel aan de putjes van een 96-wells plaat PCR.
- Voeg 5 il monster in elk putje.
- Gebruik een zelfklevende film aan de 96-wells PCR-plaat af te dichten.
- Voer de plaat op de ABI PRISM 7900HT Real Time PCR-systeem met behulp van de volgende optimale thermische cycli voorwaarden:
- Voorverwarmen bij 50 ° C gedurende 10 min
- Initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 min
- 42 cycli van
- Denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 s
- Gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min.
3. Analyse van de resultaten
Pas de drempel van de CT analyse tot 0,1 in het tabblad Analyse Instellingen. Beperk de basislijn configuraties naar Start (cyclus): 6 en End (cyclus): 15.
- Neem de cyclus drempel (Ct) waarde voor alle monsters. De cut-off waarde voor een PCR-resultaat als positief beschouwen kan worden ingesteld op een Ct-waarde van 35. De hoeveelheid bacteriën in bloed culturen varieerde van oktober 07 tot 10 11 CFU / ml, genereren Ct-waarden onder 35.
DEEL II: antibioticum gevoeligheid TESTEN
4. Isolatie van de bacteriën uit positieve bloedkweken 9
- Zuig 5 ml bouillon van een positieve bloedkweek fles en breng deze in een serum separator buis.
- Centrifugeer het serum separator buis bij 2000 xg gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant uit het serum afscheider buis.
- Transfer bacteria de gel van de buis met een steriele wattenstaafje in 0,9% zoutoplossing tot een 0,5 Mc-Farland standaard suspensie is verkregen.
5. Enten van Micro Titre platen
- Verdun de 0,5 McFarland suspensie in dubbel geconcentreerde Mueller Hinton II bouillon aan een suspensie van 5 x 10 5 CFU / ml te vormen.
- Deze suspensie aan de putjes van micro titer plaat met een selectie van antibiotica (Tabel 1).
- Incubeer de micro-titer platen bij 37 ° C gedurende 6 uur.
- Bewaar een hoeveelheid van de suspensie bij 4 ° C (als negatieve groei van controle).
- Na 6 uur incubatie overdracht van de inhoud van elk putje in een steriele buis evenals de krimp controlemonster werd opgeslagen bij 4 ° C.
- Centrifugeer de buizen bij 16000 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder voorzichtig het supernatans, zonder verstoring van de bacteriële pellet.
- Resuspendeer de pellet in steriele gedemineraliseerd H
- Verdun de monsters 10-voudig in een steriele gedemineraliseerd H 2 O.
6. Real-time 16s rDNA PCR 10
- Bereid de PCR-mengsel als volgt:
- 12,50 pl iQ SYBR Green Supermix
- 0,5 uM voorwaartse primer 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0,25 pM reverse primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- steriel gedeïoniseerd H 2 O tot een totaal volume van 20 ul
- Voeg 20 pi PCR-mengsel aan de putjes van een 96-wells plaat PCR.
- Voeg 5 il monster in elk putje.
- Gebruik een zelfklevende film aan de 96-wells PCR-plaat af te dichten.
- Voer de plaat op de MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, met behulp van de volgende optimale thermische cycli voorwaarden:
- Initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 4 min
- Initiële gloeien bij 65 ° C gedurende 30 s
- 35 cycli van
- Denaturatie 95 ° C gedurende 15 s
- Gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min.
- Smelt curve analyse (van 60-95 ° C in 20 min in stappen van 0,57 ° C)
7. Analyse van de resultaten
- Bereken de cut-off-Ct-waarde met behulp van een van de volgende formules (afhankelijk van het soort antibioticum).
- In het algemeen:
Cut-off Ct-waarde = Ct-waarde een positieve groei controle + 0,5 x (Ct-waarde een negatieve groei control - Ct-waarde een positieve groei controle) - Piperacilline, piperacilline / tazobactam en ceftazidim bij Gram-negatieve staven, amoxicilline, oxacilline en trimethoprim / sulfamethoxazol in S.aureus, amoxicilline in Enterococcus spp. Cut-off Ct-waarde = Ct-waarde een positieve groei controle + 0,25 x (Ct-waarde een negatieve groei controle - Ct-waarde een positieve groei controle)
- In het algemeen:
- Gebruik het monster geïncubeerd met steriel gedemineraliseerd H 2 O als een positieve groei controle.
- Afhankelijk van het micro-organisme, gebruik de juiste negatieve groei controle:
- Gram-negatieve staafjes Sample geïncubeerd met mengsel van antibiotica
- Enterococcus spp. Sample bewaard bij 4 ° C
- S.aureus Sample bewaard bij 4 ° C
- Bepaal de gevoeligheid (S) of weerstand (R) van de belasting voor de geteste antibioticum als volgt:
- Een Ct-waarde hoger dan de cut-off-Ct-waarde geeft de gevoeligheid
- Een Ct-waarde lager dan de cut-off-Ct-waarde geeft aan weerstand
8. Representatieve resultaten
Twee modelorganismen, dat wil zeggen een Gram-negatieve E. coli en een Gram-positieve S. aureus, zijn gekozen om de gecombineerde procedure voor de detectie en identificatie van bacteriële pathogenen en het bepalen van hun antimicrobiële profiel te visualiseren. Het eerste deel van het protocol omvat het pathogeen identificatie. Spefieke probes zijn ontworpen voor de detectie van acht klinisch relevante micro-organismen. In aanwezigheid van een doel in de bacteriële paneel worden amplificatiecurves gegenereerd en Ct worden berekend (figuur 2). De cut-off waarde voor een PCR-resultaat als positief beschouwen is ingesteld op een Ct-waarde van 35. In figuur 2A wordt de identificatie van een profiel E.coli-geïnfecteerde bloedkweek weergegeven. De 16S universele sonde is opgenomen in twee afzonderlijke reactiemengsels en daarmee genereert twee versterking curven (Ct van 25,20 en 25,95). De derde signaal wordt afgeleid van de probe specifiek voor E. coli (Ct van 27,04). De identificatie van een S. aureus-geïnfecteerde bloedkweek is getoond in figuur 2B. De 16S universele sonde heeft versterking signalen van 33,35 en 33,71. De twee overige signalen zijn afgeleid van de probes specifiek voor Staphylococcus spp. en S. aureus (Ct van 32,48 en 30,59).
figuur 3 een voorbeeld van een antibioticum gevoeligheidsbepaling amplificatie plot, die de E. coli stam die ook is aangetoond figuur 2A. Elke lijn staat voor een antibioticum dat de bacteriële monster werd geïncubeerd met. Een monster met een lage waarde Ct een monster dat groei is opgetreden in de aanwezigheid van een antibioticum, waarin tegen de geteste antibioticum. Integendeel, een hoge waarde vertegenwoordigt Ct een monster dat geen groei is opgetreden door de effectieve werking van het antibioticum, waarin gevoeligheid voor de geteste antibioticum. Tabel 1 illustreert de bepaling van de antimicrobiële profiel van de E. coli en S. aureus-isolaten. Alle Ct-waarden worden gemeld en, met behulp van de formules vermeld in het protocol tekst (7.1), twee cut-off Ct-waarden zijn berekendberekend om onderscheid te maken tussen weerstand en gevoeligheid. De stam resistent en indien het gemelde Ct lager is dan de berekende cut-off Ct waarde (en vice versa).
Figuur 1. Stroomdiagram van de ziekteverwekker identificatie en antibiotica-gevoeligheid testprocedure met behulp van real-time 16S rDNA PCR.
Figuur 2 Identification test:. Amplification percelen en fietsen drempelwaarden (Ct-waarden) een positieve bloedkweek wordt gedetecteerd door de universele 16S rDNA sonde, terwijl de specifieke probes worden gebruikt voor de identificatie van de causale ziekteverwekker.. A. versterking perceel van bloed-cultuur met E. coli, B. versterking perceel van bloedkweek met S. aureus, pseudoniem ae, Pseudomonals aeruginosa, uni, 16S universele sonde, Ecoli, Escherichia coli sonde; pseudoniem sp, Pseudomonas spp. probe, S. pneu, Streptococcus pneumoniae sonde; Strep sp, Streptococcus spp. sonde; Entero, Enterococcus spp. probe, S. aureus, Staphylococcus aureus sonde; Stafylokok sp, Staphylococcus spp. probe.
Figuur 3. Amplification perceel van antibiotica-gevoeligheid testen van een E. coli isoleren (voorbeeld 1). Elke kromme geeft een antibioticum dat de stam werd geïncubeerd met. Een eerste signaal wordt veroorzaakt door een hoge bacteriële verontreiniging, waardoor de spanning gegroeid in de aanwezigheid van de geteste antibiotica en dus tegen het antibioticum. Late signalen blijkt dat de stam niet gegroeid in de aanwezigheid van het antibioticum, met andere woorden, het is gevoelig.
| Voorbeeld 1: E. coli | Voorbeeld 2: S. aureus | ||||
| AST | Ct | R / S | AST | Ct | R / S |
| Amoxicilline 8 mg / L | 16,83 | R | Amoxicilline 0,25 mg / L | 21,03 | R |
| Amoxicilline-clavulaanzuur 8/4 mg / L | 17,36 | R | Oxacilline 2 mg / L | 25,80 | S |
| Piperacilline 16 mg / L | 16,67 | R | Vancomycine 2 mg / L | 25,20 | S |
| Piperacilline-tazobactam 16 /4 mg / L | 24,15 | S | Gentamicine 4 mg / L | 25,86 | S |
| Ciprofloxacine 1 mg / L | 29,72 | S | Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L | 24,62 | S |
| Ceftazidim 1 mg / L | 24,03 | S | |||
| Ceftazidim 8 mg / L | 26,58 | S | |||
| Gentamicine 4 mg / L | 29,83 | S | |||
| Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L | 27,60 | S | |||
| Negatieve groei controle (mengsel van antibiotica) | 30,41 | Negatieve groei controle (monster bewaard bij 4 ° C) | 27,42 | ||
| Een positieve groei controle | 16,90 | Een positieve groei controle | 20,22 | ||
| Cut-off Ct-waarde 1 * | 21,76 | Cut-off Ct-waarde 1 *** | 23,82 | ||
| Cut-off Ct-waarde 2 ** | 18,75 | Cut-off Ct-waarde 2 **** | 22,02 | ||
| * Voor amoxicilline, amoxicilline-clavulaanzuur, ciprofloxacine, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol ** Voor piperacilline, piperacilline-tazobactam, ceftazidim | *** Voor vancomycine en gentamicine **** Voor amoxicilline, oxacilline en trimethoprim-sulfamethoxazol |
Tabel 1. Bepaling van de antibiotica-gevoeligheid testen van de twee monsters (E.coli en S.aureus). Ct waarden van de PCR-test werd gekopieerd naar deze excel bestand, die berekent de twee uiterste Ct alues van de positieve en negatieve groei controle met de formules in de tekst protocol. Als een antibioticum toont een Ct-waarde lager dan de cut-off Ct waarde de stam resistent en, indien de Ct waarde hoger dan de cut-off de stam gevoelig is.
Discussion
Het protocol hier beschreven maakt de snelle identificatie van pathogenen en zorgt voor een functionele antimicrobiële profiel dat zou kunnen leiden tot het begin van de toediening van een adequate antibiotica en verhoogt dus de prognose van patiënten met infecties in het bloed. Afhankelijk van de gevraagde voorwaarden van een test, dat wil zeggen lage kosten, hoge doorvoer, minimale turn-around tijd kunnen testen voorwaarden worden aangepast. De hele procedure kan worden uitgevoerd binnen een werkdag. Bovendien kunnen de twee delen van het protocol gelijktijdig worden uitgevoerd, die aanzienlijk vermindert de doorlooptijd. Zoals hier gepresenteerd, de identificatie paneel is een selectie van de meest klinisch relevante bacteriën in ons ziekenhuis. Aangezien het algemene principe is gericht op de 16S gen regio kunnen specifieke probes andere micro-organismen worden ontworpen en toegevoegd aan de test. De volledige test werd oorspronkelijk bedoeld voor de snelle analyse van bloed culturen, maar kan ook gebruikt worden voor de verwerking van other monster materialen. Dit geldt ook voor de antibiotica die gebruikt werden voor antibiotica gevoeligheidsbepalingen: meer of antibiotica worden toegevoegd, gebaseerd op lokale resistentiepatronen en richtlijnen.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Profileringsfonds azM (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
