Summary
Дизайн простой однодневный рабочий схема бактериального возбудителя диагностика позволяет быстро признание инфекций кровотока. Включение восьми клинически значимых бактериальных целей и их антибиотик профилей сопротивление предлагает врач первоначальный взгляд на тот же день, что может привести к более адекватной терапии.
Abstract
Инфекций кровотока, связанных с высокой смертностью из-за вероятного проявления сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока 1. Таким образом, быстрое введение адекватной антибактериальной терапии имеет первостепенное значение при лечении инфекций кровотока. Важнейшим элементом в этом процессе является выбор времени, во многом зависит от результатов бактериальной идентификации и тестирования чувствительности антибиотиков. Оба эти параметры обычно получены культуры на основе тестирования, которое отнимает много времени и занимает в среднем 24-48 часов, 2, 4. Цель исследования заключалась в разработке ДНК-тесты для быстрой идентификации инфекций кровотока, а также быстрое антимикробной чувствительности. Первый тест является эубактерий 16S рДНК на основе ПЦР в реальном времени анализ дополнен видов или род-зондами 5. С помощью этих зондов, грамотрицательных бактерий, включая Pseudomonas sрр., Синегнойной палочкии кишечной палочки, а также грамположительных бактерий, включая бактерии рода стафилококки., золотистого стафилококка, Enterococcus SPP., стрептококки., и пневмококк можно было различить. С помощью этого анализа multiprobe, первый идентификации возбудителя микроорганизмов был дан через 2 часа.
Во-вторых, мы разработали полу-молекулярный тест для тестирования чувствительности к антибиотикам С. стафилококк, Enterococcus SPP. и (факультативно) аэробных грамотрицательных палочек 6. Этот анализ был основан на исследовании, в котором ПЦР был использован для измерения роста бактерий 7. Бактерии собраны непосредственно из крови культуры инкубируют в течение 6 ч при выборе антибиотиков и после SYBR Green на основе ПЦР в реальном времени анализ определяет торможение роста. Сочетание этих двух методов может направить выбор подходящего антибиотикотерапии в тот же день (рис. 1). В заключение, Молекулярный анализ и определение чувствительности к антибиотикам и предлагает более быстрой альтернативой для обнаружения патогенов и может улучшить диагностику инфекций кровотока.
Protocol
ЧАСТЬ I: ВОЗБУДИТЕЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. Подготовка образцов
Примечание: весь молекулярный рабочих, как это описано в следующем протоколе должны быть выполнены в соответствии с рекомендациями по обеспечению качества в молекулярной диагностики 3.
- Добавить 0,1 мл аликвоту крови культуру до 0,9 мл 0,9% NaCl в 1,5 мл реакционную трубку, чтобы стать 1:10 разбавленного образца. (Разбавленных с целью предотвращения КПЦР торможения).
- Центрифуга образца при 13400 х г в течение 5 мин для осаждения ДНК бактерий.
- Ресуспендируют бактериальный осадок в 100 мкл стерильной деминерализованной H 2 O.
- Храните образец ДНК при температуре 4 ° С до дальнейшего использования.
2. Идентификация Анализ: в режиме реального времени 16 рДНК ПЦР
- Подготовка реакционной смеси следующим образом. Анализ состоит из четырех отдельных реакций на пробу. Каждая смесь включает в себя 12,50 мкл мастерсмеси, 0,9 мкМ прямого праймера (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3), 7, 0,6 мкм обратный праймер (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3), 8 и панель датчиков. Количество датчиков выдается на каждое из четырех отдельных реакций ниже.
- Первая реакция включает в себя:
- 0,2 мкМ универсальный датчик (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0,2 мкМ P. Зонд палочки (5-Джо-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- Вторая реакция включает в себя:
- 0,2 мкМ E. палочки зонда (5-Джо-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 мкМ Pseudomonas SPP. Зонд (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- Третья реакция включает в себя:
- 0,2 мкМ рода стафилококки. Зонд (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0,2 мкМ С. золотистого зонда (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0,2 мкМ Enterococcus SPP. (5-Джо-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- Четвертая реакция включает в себя:
- 0,2 мкМ универсальный датчик (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 мкМ стрептококки. Зонд (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0,2 мкМ С. пневмонии зонда (5-Джо-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Добавить стерильной деминерализованной H 2 O, чтобы достичь общего объема 20 мкл. Добавьте 20 мкл реакционной смеси в лунках 96-луночного планшета PCR.
- Добавьте 5 мкл образца в каждую лунку.
- Используйте клейкую пленку, чтобы запечатать 96-луночного ПЦР пластины.
- Запустите пластину на PRISM ABI 7900HT ПЦР в реальном времени системы, используя следующий оптимальный тепловой режим езда на велосипеде:
- Предварительного нагрева при температуре 50 ° С в течение 10 мин
- Начальная денатурация при 95 ° С в течение 15 минут
- 42 циклов
- Денатурации при 95 ° C в течение 15 секунд
- Отжиг при температуре 60 ° С в течение 1 мин
3. Анализ результатов
Отрегулируйте порог Анализ Ct 0.1 на вкладке Настройка анализа. Ограниченный базовой конфигурации в меню Пуск (цикл): 6 и End (цикл): 15.
- Запишите цикл порог (Ct) значение для всех образцов. Пороговое значение для рассмотрения ПЦР положительный результат может быть установлен в значение Ct-35. Количество бактерий, присутствующих в крови культур колебалась от 10 7 до 10 11 КОЕ / мл, создавая Ct значения ниже 35.
ЧАСТЬ II: антибиотикам ВОСПРИИМЧИВОСТЬ
4. Выделение бактерий с положительными посевами крови 9
- Аспирируйте 5 мл отвара из положительной культуры крови бутылку и передать его в сыворотке труба сепаратора.
- Центрифуга сыворотки трубы сепаратор при 2000 мкг в течение 10 мин.
- Удалите супернатант из сыворотки трубы сепаратор.
- Передача BACteria из гелевого слоя трубки стерильным ватным тампоном на 0,9% физиологического раствора до 0,5 McFarland стандартной суспензии.
5. Прививка от Micro Плиты титром
- Развести 0,5 McFarland подвески в двойном концентрированный Мюллер Хинтон II бульон с образованием суспензии 5 х 10 5 КОЕ / мл.
- Добавить эту подвеску в скважинах микроволновая плита титр, содержащий подборку антибиотиков (табл. 1).
- Инкубируйте микроволновая плита титр при 37 ° С в течение 6 часов.
- Хранить аликвоту суспензии при температуре 4 ° С (в качестве отрицательного контроля роста).
- Через 6 ч инкубации, передать содержание каждого и в стерильную пробирку, а также отрицательный контрольный образец роста, который хранили при 4 ° C.
- Центрифуга труб на 16 000 мкг в течение 5 мин.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая бактериальный гранул.
- Ресуспендируйте осадок в стерильной деминерализованной Н
- Разбавьте образцы в 10 раз стерильным деминерализованной H 2 O.
6. В режиме реального времени 16 рДНК ПЦР 10
- Подготовьте смесь ПЦР следующим образом:
- 12,50 мкл IQ SYBR Green Supermix
- 0,5 мкМ прямого праймера 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0,25 мкм обратный 16S-2 праймера (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- стерильный деминерализованной H 2 O в общем объеме 20 мкл
- Добавить 20 мкл смеси ПЦР в лунки 96-луночного планшета PCR.
- Добавьте 5 мкл образца в каждую лунку.
- Используйте клейкую пленку, чтобы запечатать 96-луночного ПЦР пластины.
- Запустите пластину на MyiQ одноцветных Real-Time PCR система обнаружения, используя следующий оптимальный тепловой режим езда на велосипеде:
- Начальная денатурация при 95 ° С в течение 4 минут
- Начальная отжига при температуре 65 ° C в течение 30 с
- 35 циклов
- Денатурация на 95 ° C в течение 15 секунд
- Отжиг при температуре 60 ° С в течение 1 мин
- Растопить анализа кривой (от 60-95 ° C в течение 20 мин с шагом 0,57 ° C)
7. Анализ результатов
- Рассчитать отсечения Ct значение, используя один из следующих формул (в зависимости от типа антибиотиков).
- В общем:
Пороговые значения Ct = Ct значение положительного контроля рост + 0,5 х (Ct значение отрицательного контроля роста - Ct значение положительного контроля роста) - Пиперациллин, пиперациллин / тазобактам и цефтазидим в грамотрицательные палочки, амоксициллин, оксациллин и триметоприм / сульфаметоксазол в S.aureus, Enterococcus амоксициллин в SPP. Пороговые значения Ct = Ct значение положительного контроля роста + 0,25 х (Ct значение отрицательного роста контроль - Ct значение положительного контроля роста)
- В общем:
- Используйте образец инкубировали с деминерализованной стерильной H 2 O в качестве положительного контроля роста.
- В зависимости от микроорганизма, использовать соответствующий отрицательный контроль роста:
- Грамотрицательные палочки образец инкубировали со смесью антибиотиков
- Enterococcus SPP. Пример хранить при температуре 4 ° C
- S.aureus Пример хранить при температуре 4 ° C
- Определение чувствительности (S) и сопротивления (R) деформации для испытания антибиотика следующим образом:
- Значение Ct выше порогового значения Ct указывает восприимчивость
- Значение Ct ниже порогового значения Ct указывает сопротивление
8. Представитель Результаты
Два модельных организмов, т.е. грамотрицательными E. палочки и грамположительные С. стафилококк, которые выбрали себе комбинированные процедуры для выявления и идентификации патогенных бактерий и определения их антимикробной профиля. Первая часть включает в себя протокол возбудителя идентификации. Specific зонды, предназначенные для обнаружения восьми клинически значимых микроорганизмов. При наличии цели включены в бактериальным панели, усиление кривые создаются и Ct значения вычисляются (рис. 2). Пороговое значение для рассмотрения ПЦР положительный результат, как установлено в значение Ct 35. В рисунке 2А, определение профиля E.coli-инфицированной кровью культуре показано на рисунке. Зонд 16S универсальный включены в две отдельные реакционные смеси и, следовательно, порождает два усиление кривых (КТ 25,20 и 25,95). Третий сигнал получен от зонда, специфичные для E. палочки (КТ 27,04). Определение С. золотистого-инфицированных культуры крови показано на рисунке 2Б. Зонд универсальный 16S имеет усиление сигналов 33,35 и 33,71. Два оставшихся сигналов, полученных от датчиков, специфичных для рода стафилококки. и С. золотистый (КТ 32,48 и 30,59).
На рисунке 3 показан пример тестирования чувствительности к антибиотикам усиления сюжета, представляющий штамм кишечной палочки, что было также показано, на рисунке 2А. Каждая строка представляет один антибиотик, что бактериальная образец инкубировали с. Образец с низким значением Ct пример, в котором рост произошел в присутствии антибиотика, с указанием сопротивления испытанных антибиотиков. Напротив, высокое значение Ct представляет собой образец, в котором нет роста произошло из-за эффективной работы антибиотиков, указывая на чувствительность к антибиотикам проверенных. В таблице 1 приведены определения антимикробной профиль E. палочки и С. золотистого изолятов. Все значения Ct сообщается и, используя формулы, упомянутых в тексте протокола (7.1), два отсечения Ct значения расчетовсвязать с различие между сопротивлением и восприимчивости. Штамм устойчив к антибиотикам, если сообщалось Ct стоимость ниже, чем расчетные отсечения Ct значение (и наоборот).
Рисунок 1. Схема возбудителя и определение антибиотиков процедура тестирования чувствительности использования в режиме реального времени 16S рДНК ПЦР.
Рисунок 2 Идентификация анализа. Усиление участков и цикла пороговые значения (Ct значения) положительной культуры крови обнаружен универсальный 16S рДНК, а конкретные зонды используются для идентификации причинных патогенов.. А. усиление участка кровь культуры, содержащее Е. палочки, Б. усиление участка кровь культуры, содержащие С. золотистый, псев всюду, Pseudomonкак палочки, UNI, 16S универсальный датчик, Ecoli, кишечная палочка зонд; псев зр, Pseudomonas SPP. Зонд, С. пневмонии, пневмококк зонд; Strep Испания, стрептококки. Зонд, Entero, Enterococcus SPP. Зонд, золотистого стафилококка, золотистого стафилококка зонд, Staph зр, бактерии рода стафилококки. зонда.
Рисунок 3. Усиление участка антибиотикам чувствительность E. палочки изолировать (пример 1). Каждая кривая представляет собой один антибиотик, что штамм инкубируют с. Ранний сигнал обусловлен высокой бактериальной нагрузки, которая означает, что напряжение возросло в присутствии испытанных антибиотиков и, таким образом, устойчивые к антибиотикам. Позднее сигналы показывают, что штамм не выросли в присутствии антибиотика, другими словами, он подвержен.
| Пример 1: E. палочки | Пример 2: S. золотистый | ||||
| АСТ | Коннектикут | R / S | АСТ | Коннектикут | R / S |
| Амоксициллин в дозе 8 мг / л | 16,83 | R | Амоксициллин 0,25 мг / л | 21,03 | R |
| Амоксициллин-клавуланат 8/4 мг / л | 17,36 | R | Оксациллин 2 мг / л | 25,80 | S |
| Пиперациллин 16 мг / л | 16,67 | R | Ванкомицин 2 мг / л | 25,20 | S |
| Пиперациллин-тазобактам 16 /4 мг / л | 24,15 | S | Гентамицин в дозе 4 мг / л | 25,86 | S |
| Ципрофлоксацин 1 мг / л | 29,72 | S | Триметоприм-сульфаметоксазола 2/38 мг / л | 24,62 | S |
| Цефтазидим 1 мг / л | 24,03 | S | |||
| Цефтазидим 8 мг / л | 26,58 | S | |||
| Гентамицин в дозе 4 мг / л | 29,83 | S | |||
| Триметоприм-сульфаметоксазола 2/38 мг / л | 27,60 | S | |||
| Отрицательный контроль роста (смесь антибиотиков) | 30,41 | Отрицательный контроль роста (образец хранится при температуре 4 ° С) | 27,42 | ||
| Положительный контроль роста | 16,90 | Положительный контроль роста | 20,22 | ||
| Пороговые значения Ct-1 * | 21,76 | Пороговые значения Ct-1 *** | 23,82 | ||
| Пороговые значения Ct-2 ** | 18,75 | Пороговые значения Ct-2 **** | 22,02 | ||
| * Для амоксициллин, амоксициллин-клавуланат, ципрофлоксацин, gentamicв, триметоприм-сульфаметоксазол ** Для пиперациллин, пиперациллин тазобактам-, цефтазидим | *** Для ванкомицин и гентамицин Для **** амоксициллин, оксациллин и триметоприм-сульфаметоксазол |
Таблица 1. Определение антибиотиков тестирования восприимчивости двух образцов (E.coli и S.aureus). Ct значения ПЦР-анализа были скопированы на данный файл Excel, в качестве которого может автоматически вычисляет две отсечки Ct alues из положительного и отрицательного контроля роста, используя формулы показаны в текст протокола. Если антибиотик показывает значение Ct ниже порогового значения Ct, штамм устойчив к антибиотикам, если значение Ct была выше, чем отсечения, штамм восприимчив.
Discussion
Протокол, описанный здесь, позволяет быстро выявлять возбудителей и обеспечивает функциональную антимикробной профиля, которые могут привести к раннему администрации адекватных антибиотиков тем самым улучшая прогноз для пациентов с инфекциями кровотока. В зависимости от запрашиваемой условия теста, то есть низкая стоимость, высокая пропускная способность, минимальный оборот вокруг время, условия проведения испытаний могут быть скорректированы. Вся процедура может быть выполнена в течение одного рабочего дня. Кроме того, две части протокола могут быть выполнены одновременно, что снижает оборот вокруг время значительно. Как показано здесь, выявление панель выбора наиболее клинически значимых бактерий в нашей больнице. Поскольку основной принцип ориентации региона 16S гена, зондами для других микроорганизмов могут быть разработаны и добавлены в анализе. Полный анализ был первоначально предназначен для экспресс-анализа крови культур, но также может быть использован для обработки выводаМатериалы термо образца. Это также относится к антибиотикам, которые были использованы для тестирования чувствительности к антибиотикам: более или другие антибиотики могут быть добавлены, исходя из местных моделей устойчивости и руководящих принципов.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Profileringsfonds манатов (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
