Summary
وVisioTracker هو نظام آلي لتحليل كمي لأداء البصرية من الأسماك البالغة اليرقات الصغيرة ويعتمد على تسجيل حركات العين. ويتميز السيطرة الكاملة على خصائص التحفيز البصري والتحليل في الوقت الحقيقي، وتمكين عالية الإنتاجية البحوث في مجالات مثل تطوير النظام البصرية وظيفة، والصيدلة، والدراسات الدوائر العصبية الحسية والتكامل.
Abstract
التحقيقات في تطوير النظام البصري وظيفة تتطلب النماذج السلوكية القابلة للقياس الكمي للأداء البصرية التي هي سهلة لاستخلاص أدلة، قوية، وسهلة للتلاعب. تم العثور على نموذج مناسب في استجابة حركة العين (OKR)، والسلوك الانعكاسي موجودة في جميع الفقاريات نظرا لقيمتها العالية التحديد. وينطوي OKR بطيئة التحفيز التالية حركات العينين تناوبت مع إعادة saccades السريع. ويتم بسهولة قياس هذا السلوك في يرقات اسماك الزرد، وذلك بسبب ظهور في وقت مبكر ومستقرة (تطويره بالكامل بعد 96 ساعة الإخصاب آخر (HPF))، والاستفادة من معرفة وافية حول علم الوراثة الزرد، على مدى عقود واحدة من طراز المفضل الكائنات الحية في هذا المجال. وفي الوقت نفسه اكتسب تحليل آليات مماثلة في الأسماك البالغة الأهمية، ولا سيما بالنسبة للتطبيقات الدوائية والسمية.
نحن هنا وصف VisioTracker، ومؤتمتة بالكامل، وارتفاع throughpuر نظام للتحليل الكمي للأداء البصرية. ويستند هذا النظام على البحوث التي أجريت في مجموعة من البروفيسور ستيفان Neuhauss وأعيد تصميم أنظمة TSE. وهو يتكون من جهاز شل حركة الأسماك الصغيرة لرصد بواسطة كاميرا الفيديو عالية الجودة مجهزة عدسة التكبير عالية الدقة. ويحيط الحاوية الأسماك شاشة أسطوانية، التي يمكن ان يتوقع أنماط التحفيز الحاسوب ولدت. وتسجل حركات العين وتحليلها تلقائيا من قبل VisioTracker حزمة البرامج في الوقت الحقيقي.
تحليل البيانات يمكن الاعتراف الفوري من المعلمات مثل مدة المرحلة بطيئة وسريعة، وحركة التردد دورة، وزيادة بطيئة المرحلة، حدة البصر، والحساسية النقيض.
نتائج نموذجية تسمح على سبيل المثال التعرف السريع على النظام البصري المسوخ التي لا تظهر أي تغيير واضح في التشكل نوع البرية، أو تحديد كمية الآثار الدوائية أو السامة من والتشوهات الخلقيةوكلاء على أداء النظام البصري.
Protocol
1. تربية الأسماك
وأبقى الأجنة والتي أثيرت في إطار الظروف القياسية (الاسم التجاري 2002) وفقا لنظم تطوير التخصيب في آخر أيام (DPF). واستخدمت الكبار واليرقات في 5 DPF للمقاييس.
2. الإجراء التجريبي
- إعداد صك
اليرقات: وجزءا لا يتجزأ من يرقات الأسماك في 3٪ قبل تحسنت (28 ° C) ميثيل لمنع حركات الجسم. وضعت الأجنة الجانب الظهري حتى في VisioTracker، التي تواجه شاشة إسقاط. وكانت الأسماك تخدير لفترة وجيزة في 300 ملغ / لتر MS-222، مزودة في جهاز شل حركة ووضعها في VisioTracker: الأسماك البالغة. بدأت قبل القياسات، وتركوا لاسترداد لمدة 1-2 دقيقة.
- جيل من أنماط التحفيز
تم إنشاء أنماط التحفيز الرأسي تتكون من حواجز شبكية شرط لا الموجة السوداء والبيضاء تدور حول الأسماكباستخدام حزمة برمجيات احتكارية. فإنها يمكن أن تكون من خلال التضمين حزمة البرامج وفقا لشكل الموجة، وعلى النقيض، شدة وسرعة الزاوي والتردد المكاني. وكان من المتوقع أنماط على الشاشة باستخدام جهاز عرض رقمي ضوء الوارد في VisioTracker. كان المسافة التقريبية بين العين الأسماك وشاشة 4.5 سم، وحجم العرض على الشاشة أفقيا كان 360 درجة و 55 درجة عموديا. بالنسبة للأسماك اليرقات، تم تغيير اتجاه التحفيز مع تردد قدره 0.33 هرتز للحد من وتيرة حركة العين. وحفز الأسماك البالغة unidirectionally وفقط اعتبر العين في حفز الزمنية إلى الأنف الاتجاه، منذ الأنف إلى سرعة الزمنية العين بشكل عام هو أقل من ذلك بكثير وأقل المستمر (يرجى الرجوع إلى مولر وNeuhauss، 2010).
- تسجيل حركات العين
كان يأكل A-الصورة المشرقة مجال رأس السمكة إلى كاميرا فيديو بالأشعة تحت الحمراء. وتم تحقيق الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء من الأسماك و ROM أدناه. سجلت الكاميرا الصور بمعدل من 5 إطارات / ثانية (اليرقات) أو 12.5 إطارات / ثانية (للبالغين)، على التوالي. تتم معالجة الصور تلقائيا، وتصحيح ممهدة لشكل العين. ثم تم تحديد التوجه العين فيما يتعلق المحور الأفقي تلقائيا وحساب سرعة العين من خلال حزمة البرمجيات الاحتكارية. تم تصحيح تلقائيا حركات صغيرة من الأسماك لمن قبل البرنامج. وقد تحقق كل تسجيل وتحليل في الوقت الحقيقي.
3. بعد معالجة البيانات التجريبية
- تم تصفيتها القياسات الخام للسرعات العين saccades من أجل انتزاع بطيئة السرعة المرحلة.
- وممهدة حركة العين، تمت تصفيتها منحنيات السرعة العين بمتوسط تعمل مع نافذة انزلاق من 7 إطارات.
- وقد بلغ متوسط سرعة العين على الإطارات مع الظروف التحفيز متطابقة.
- بالنسبة للأسماك اليرقات، وبلغ متوسط سرعة العين على كلتا العينين.
4. ممثل النتائج:
معشوقة = "jove_content"> من أجل تقييم قدرات VisioTracker للأسماك اليرقات والكبار، وأجريت تجارب على يرقات اسماك الزرد في 5 DPF، والزرد الكبار.
لاسماك الزرد اليرقات، تم اختيار متحولة الوفير. في هذه العدسة، متحولة الخلايا الظهارية hyperproliferate، مما أدى إلى انخفاض حجم العدسة والمكان خارج الرحم للعدسة. وترد هذه التعديلات الشكلية من قبل الحد بدرجة كبيرة من التباين وحساسية حدة البصر (Schonthaler وآخرون، 2010). الشكل 1 يوضح الفرق في الحساسية النقيض من المسوخ الوفير مقابل من النوع البري الأشقاء. المسوخ الوفير تفشل على نحو متزايد لضبط سرعة العين كما النقصان النقيض التحفيز. عن طريق القياس، عندما يتم زيادة وتيرة التحفيز المكانية، أي يتم تقليل عرض شريط التحفيز، المسوخ الوفير بالمثل تبرهن خفض حدة البصر (الشكل 2)
اعتماد الكبار اسماك الزرد visuaوكان التحقيق الأداء L في الظروف البيئية عن طريق إخضاع الأسماك لتركيزات مختلفة من الكحول في الماء دبابتهم لمدة 30 دقيقة في وقت لاحق وقياس حركة العين استجابة التحفيز في ظل ظروف مختلفة. اسماك الزرد الكبار تظهر انخفاض ملحوظ في حساسية التباين عند الاحتفاظ بها في تركيزات الكحول زيادة (الشكل 3). ويمكن ملاحظة مماثلة A تعتمد على الجرعة الحد من سرعة العين العامة على نطاق واسع من الترددات المكانية عندما تم علاج الأسماك بتركيزات الكحول زيادة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك العلاج الكحول الجرعة بشكل تابع يقلل أداء المحرك للعين في أكثر من المهام الشاقة والتي تجلت في زيادة سرعات التحفيز (الشكل 5).
الشكل 1. اسماك الزرد سرعة العين اليرقات تعتمد على النقيض من التحفيز. وقد تم تحليل طفرات الوفير 10 و 10 الأشقاء من النوع البري في 5 DPF تحت متفاوتة ق شروط timulus الشريط المقابل. يبين الرسم البياني متوسط سرعة العين ± 1 SEM.
الشكل 2. اسماك الزرد سرعة العين اليرقات تعتمد على التردد المكاني. وتعرض المسوخ الوفير 10 و 10 الأشقاء من النوع البري لمختلف بعرض شريط التحفيز في 5 DPF وتحليلها كما هو موضح. يبين الرسم البياني متوسط سرعة العين ± 1 SEM.
الشكل 3. الكبار الكحول عرض اسماك الزرد تعتمد على التركيز في الحد من حساسية التباين. واستمرت في اسماك الزرد الكبار متفاوتة تركيزات الكحول على النحو المشار إليه لمدة 30 دقيقة وتحليلها تحت ظروف مختلفة التحفيز على النقيض شريطية. الرسم البياني يوضح معدل السرعة الزمنية العين إلى الأنف ± 1 من 9 SEM الأسماك لكل مجموعة (باستثناء المجموعة الضابطة: ن = 11).
ه 4 "SRC =" / files/ftp_upload/3556/3556fig4.jpg "/>
الشكل 4. الكحول الكبار عرض اسماك الزرد تعتمد على التركيز في الحد من حركة العين شاملة على مجموعة واسعة من الشريط عرض الحوافز. واستمرت في اسماك الزرد الكبار متفاوتة تركيزات الكحول على النحو المشار إليه لمدة 30 دقيقة وتحليلها تحت ظروف مختلفة التحفيز عرض الشريط. الرسم البياني يوضح معدل السرعة الزمنية العين إلى الأنف ± 1 من 9 SEM الأسماك لكل مجموعة (باستثناء المجموعة الضابطة: ن = 11).
الشكل 5. الكبار الكحول عرض اسماك الزرد تعتمد على التركيز في الحد من حركة العين شاملة على مجموعة واسعة من سرعات التحفيز. واستمرت في اسماك الزرد الكبار متفاوتة تركيزات الكحول على النحو المشار إليه لمدة 30 دقيقة وتحليلها تحت ظروف متفاوتة السرعة التحفيز. الرسم البياني يوضح معدل السرعة الزمنية العين إلى الأنف ± 1 من 9 SEM الأسماك لكل مجموعة (باستثناء المجموعة الضابطة:ن = 11).
Discussion
وقد تم الاعتراف بأهمية OKR لدراسة وظيفة البصرية في المجتمع العلمي لفترة طويلة (عيد الفصح ونيكولا 1996، 1997)، ومحاولات لتحديد نموذج حقا لقد بدأت بشكل جيد أكثر من عشر سنوات. عيد الفصح وضعت نقولا (1996) مع نظام التناوب آلية الطبول شريطية، حيث تم تحليل تسجيل الفيديو من حركة العين يدويا. عانى هذا النظام من عدم وجود تجميد الجنين الأسماك، الأمر الذي يتطلب اعادة تموضع دليل متكررة، ويمكن الكشف عن الحركات تتبع من العيون إلا بصعوبة بالغة. خطوة إلى الأمام استخدام طبل الفيديو المتوقعة مخطط للسماح لمزيد من التحفيز متغير العرض الكمبيوتر ولدت (ROESER وباير، 2003؛ Rinner وآخرون، 2005A).
وقد ثبت دليل في الغالب، والإطار حسب الإطار تحليل تسجيلات بالفيديو لتكون شاقة للغاية، وإلى حد ما يعوقها التحيز المراقب (بيك وآخرون،2004). واقترح التحليل الآلي في الوقت الحقيقي للسماح باستخدام آليات التعلم السلوكية من الملاحظات (الكبرى وآخرون، 2004). وقد تم استخدام الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء والتردد التي تسيطر عليها المحفزات الدورية رائدها بيك وآخرون (2004). ومع ذلك، وصفت النظام هناك فقط وقد تم استخدامها ليرقات، وإجراء تحليل خارج الشبكة. علاوة على ذلك، يسمح VisioTracker سيطرة كاملة على المحفزات، بما في ذلك تغيير التحفيز أثناء التجربة، مما يتيح قدرا أكبر من المرونة والنفوذ عفوية على مسار التجربة. أيضا، تغلبت إنشاء التحفيز الرقمية المستخدمة من قبل VisioTracker المشاكل المذكورة سابقا مع تسارع من كتلة خاملة من طبل التحفيز مخطط (بيك وآخرون، 2004).
ضبط النفس من قبل اليرقات ميثيل لا تتدخل بشكل كبير مع حركة العين وليس لديها أي آثار طويلة الأجل على رفاهية الزرد. وكانت يرقات الأسماك بنجاحجزءا لا يتجزأ من الحفاظ على ميثيل لعدة أيام، حتى امدادات الاوكسجين عن طريق الجلد أصبح غير كاف للطلب مع زيادة العمر (تشيان وآخرون، 2005).
وتقييدي الأسماك طريقة الكبار على حد سواء من السهل على الحيوان. قصر مدة التجربة، إلى جانب خيار تبادل بسرعة الحيوان اختبار لمختلف واحد، يضيف المزيد إلى الجوانب الإيجابية لرعاية الحيوان النظام. منذ يتم مسح مستمر الخياشيم عن طريق المياه، وهو ملائمة لارتفاع الماء مع أي مادة كيميائية في الاختيار لدراسة تأثيرها على حركات العين والأداء البصري. وبالمثل يمكن أن تضاف تجربة غسيل المغادرة دون الحاجة للتعامل مع الحيوان بين التجارب.
تم تصغير الضوضاء بكسل في الصورة الفيديو من خلال تخفيف خوارزميات من البرنامج VisioTracker الملكية، مما يتيح درجة عالية قياسات دقيقة للموقف العين والسرعة الزاوية. وعلاوة على ذلك، لتسهيل إحصائيةتحليل، برنامج تخرج الحركات التي تحدث في رمشي سرعة ثابتة ولا تساهم في بيان التجريبية. وسهلت سرعة في المتوسط من المنحنيات على إطارات الفيديو 7 تحليلها لاحقا.
وVisioTracker يفتح بعدا جديدا لكثير من مجالات البحث المختلفة. وقد تم بالفعل النظام وسابقاتها المستخدمة لقياس الأداء بنجاح البصرية في يرقات اسماك الزرد، وذلك باستخدام المعلمات مثل حدة البصر، والحساسية التباين والتكيف الخفيفة (Rinner وآخرون، 2005A، Schonthaler وآخرون، 2010)، لتحليل وظيفي لل مبصرات مخروط بعد التلاعب أعضاء من الشبكة البصرية تنبيغ (مثل Rinner وآخرون، 2005b، ريننجر وآخرون، 2011.)، أو تحليل العيوب البصرية في يرقات اسماك الزرد متحولة (مثل Schonthaler وآخرون، 2005، 2008؛ Bahadori وآخرون، 2006). الترابط بين النضج المورفولوجية والوظيفية للنظام البصريوقد درست من قبل القياسات OKR لإظهار ذلك أساسا إلى أن حدة البصر سبيل المثال لا الحصر تماما من تباعد مبصرة في مراحل اليرقات (هوغ وآخرون، 2010).
وVisioTracker مناسبة بالتساوي لتحليل وظيفة البصرية في الزرد الكبار وغيرها من أنواع الأسماك مماثلة الحجم (مولر وNeuhauss (2010)، فإن هذا التقرير).
ومن الممكن أيضا تصور للاستفادة من النظام في المجالات البحثية مثل علم السموم أو الأدوية حيث يمكن إضافة المواد إلى التحقيق لتدفق المياه المحيطة الخياشيم الأسماك البالغة. وعلاوة على ذلك، نجد أن تنوع التحليلات VisioTracker تمكن أكثر دقة على سبيل المثال من ontogenetics وظيفة البصرية، العصبية وظيفة الدوائر والتنمية، أو الحسية السيطرة (انظر الاستعراض في هوانغ وNeuhauss، 2008).
Disclosures
أوليفر DR Schnaedelbach وهولجر Russig D. هم موظفون من TSE SYSTEMS GMBH التي تنتج تتبع أداء النظام البصري المستخدمة في هذه المقالة. وقد رعت إنتاج هذه المادة TSE SYSTEMS GMBH. ستيفان CF Neuhuass هو موظف في جامعة زيوريخ الذي يتلقى الأجر من قبل أنظمة TSE لكل نظام بيعها.
Acknowledgments
وأيد الاتحاد الأوروبي FP7 KPM من (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
- Bahadori, R., Rinner, O., Schonthaler, H. B., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. V., Paris, R., Jagadeeswaran, P., Neuhauss, S. C. F. The fade out mutant is a novel genetic model for Hermansky-Pudlak syndrome. Investigative Optical and Visual Sciences. 47, 4523-4531 (2006).
- Beck, J. C., Gilland, E., Baker, R., Tank, D. W. Instrumentation for measuring oculomotor performance and plasticity in larval organisms. Methods in Cell Biol. 76, 383-411 (2004).
- Brand, M. G. M., Nüsslein-Vollhard, C. Keeping and raising Zebrafish. Zebrafish, Practical Approach Series. Nüsslein-Vollhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Biol. 180, 646-663 (1996).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of eye movements in the zebrafish (Danio rerio). Dev. Psychobiol. 31, 267-276 (1997).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Visual acuity in zebrafish: behavior and histology. Frontiers in Zoology. 7, 8-8 (2010).
- Huang, Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience. 13, 1899-1916 (2008).
- Major, G., Baker, R., Aksaya, E., Mensh, B., Seung, H. S., Tank, D. W. Plasticity and tuning by visual feedback of the stability of a neural integrator. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101, 7739-7744 (2004).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. F. Quantitative Measurements of the optokinetic response in adult fish. J. Neurosci. Meth. 186, 29-34 (2010).
- Neuhauss, S. C. F., Biehlmaier, O., Seeliger, M. W., Das, T., Kohler, K., Harris, W. A., Baier, H. Genetic disorders of vision revealed by a behavioral screen of 400 essential loci in zebrafish. J. Neurosci. 19, 8603-8615 (1999).
- Qian, H., Zhu, Y., Ramsey, D. J., Chappell, R. L., Dowling, J. E., Ripps, H. Directional asymmetries in the optokinetic response of larval zebrafish. Zebrafish. 2, 189-196 (2005).
- Renninger, S. L., Gesemann, M., Neuhauss, S. C. F. Cone arrestin confers cone vision of high temporal resolution in zebrafish larvae. Eur. J. Neurosci. 33, 658-667 (2011).
- Rick, J. M., Horschke, I., Neuhauss, S. C. F. Optokinetic behavior is reversed in achiasmatic mutant zebrafish larvae. Curr. Biol. 10, 595-598 (2000).
- Rinner, O., Rick, J. M., Neuhauss, S. C. F. Contrast sensitivity, spatial and temporal tuning of the larval zebrafish optokinetic response. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 137-142 Forthcoming.
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O. S., Neuhauss, C. F. Knockdown of cone specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone-response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. J. Neurosci. 23, 3726-3734 (2003).
- Schonthaler, H., Fleisch, V. C., Biehlmaier, O., Makhankov, Y. M., Rinner, O., Bahadori, R., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant leberkn del/vam6 resembles human multi-systemic disorders caused by aberrant trafficking of endosomal vesicles. Development. 135, 387-399 (2008).
- Schonthaler, H. B., Franz-Odendaal, T. A., Hodel, C., Gehring, I., Schwarz, H., Neuhauss, S. C. F., Dahm, R. The zebrafish mutant bumper shows a hyperproliferation of lens epithelial cells and fibre cell degeneration leading to functional blindness. Mech. Dev. 127, 203-219 (2010).
- Schonthaler, H. B., Lampert, J. M., Lintig, J. von, Schwarz, H., Geisler, R., Neuhauss, S. C. F. A mutation in the pmel17 gene leads to defects in melanosome biogenesis and alterations the visual system in the zebrafish mutant fading vision. Developmental Biology. 284, 231-242 (2005).
