Summary
Le VisioTracker est un système automatisé pour l'analyse quantitative de la performance visuelle des poissons adultes et des larves petit basée sur l'enregistrement des mouvements oculaires. Il dispose d'un contrôle total sur les propriétés de stimulation visuelle et analyse en temps réel, ce qui permet à haut débit recherches dans des domaines tels que le développement du système visuel et de la fonction, de la pharmacologie, des études de circuits neuronaux et de l'intégration sensori-motrice.
Abstract
Les enquêtes sur le développement du système visuel et la fonction nécessite quantifiables modèles comportementaux de performances visuelles qui sont faciles à obtenir, robuste et simple à manipuler. Un modèle approprié a été trouvé dans la réponse optocinétique (OKR), un comportement réflexif présente chez tous les vertébrés en raison de sa valeur de sélection de haut. L'OKR implique lents stimulus suivantes mouvements des yeux alternaient avec des saccades rapides rappel. La mesure de ce comportement est facilement réalisée chez les larves de poisson zèbre, en raison de sa précocité et stable (entièrement développée après 96 heures après la fécondation (hpf)), et bénéficiant d'une connaissance approfondie sur le poisson zèbre génétique, depuis des décennies l'un des modèle favorisée organismes dans ce domaine. En attendant l'analyse des mécanismes similaires dans les poissons adultes a gagné en importance, en particulier pour des applications pharmacologiques et toxicologiques.
Nous décrivons ici VisioTracker, un système entièrement automatisé, à haut throughpusystème de t pour l'analyse quantitative de la performance visuelle. Le système est basé sur des recherches effectuées dans le groupe du Prof Stephan Neuhauss et a été re-conçu par les systèmes EST. Il se compose d'un dispositif de blocage pour les petits poissons surveillée par une caméra vidéo de haute qualité équipé d'un objectif zoom haute résolution. Le récipient de poisson est entouré d'un tamis à tambour, sur lequel configurations de stimulus générés par ordinateur peut être projetée. Les mouvements oculaires sont enregistrées et analysées automatiquement par le logiciel VisioTracker en temps réel.
L'analyse des données permet la reconnaissance immédiate des paramètres tels que la durée de la phase lente et rapide, la fréquence du cycle de mouvement, lent-phase et de gain, l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste.
Des résultats typiques permettent par exemple l'identification rapide des mutants du système visuel qui ne présentent aucune altération apparente dans la morphologie de type sauvage, ou la détermination des effets quantitatifs de la pharmacologiques ou toxiques et mutagènesagents sur les performances du système visuel.
Protocol
1. L'élevage de poissons
Les embryons ont été conservés et élevés dans des conditions standard (Marque 2002) et mis en scène en fonction du développement de jours après la fécondation (dpf). Les adultes et les larves à 5 dpf été utilisé pour les mesures.
2. Procédure expérimentale
- Préparation d'instrument
Larves: Les larves de poissons ont été embarqués dans 3% préchauffé (28 ° C) de méthylcellulose pour empêcher les mouvements du corps. Les embryons ont été placés face dorsale dans la VisioTracker, face à l'écran de projection. Les poissons adultes: poissons ont été brièvement anesthésiés dans 300 mg / l de MS-222, inséré dans le dispositif d'immobilisation et placé dans le VisioTracker. Avant de mesures ont été initiées, ils ont été laissés au repos pendant 1-2 min.
- Génération de configurations de stimulus
Configurations de stimulus consistant verticales en noir et blanc sinusoïdaux grilles tournantes autour du poisson ont été créésen utilisant le logiciel propriétaire. Ils pourraient être modulée par le logiciel en fonction de la forme d'onde, le contraste, l'intensité, la vitesse angulaire et la fréquence spatiale. Modèles ont été projetées sur l'écran à l'aide d'un projecteur numérique de la lumière contenue dans le VisioTracker. La distance approximative entre l'œil du poisson et l'écran est de 4,5 cm, et la taille de projection sur écran 360 degrés à l'horizontale était et 55 ° verticalement. Pour les larves de poissons, la direction de stimulation a été modifiée avec une fréquence de 0,33 Hz pour réduire la fréquence des saccades. Les poissons adultes ont été stimulées unidirectionnelle et que l'oeil stimulé dans temporelle-à-nasale direction a été pris en considération, puisque la vitesse de l'œil nez-à-temporelle est en général nettement plus bas et moins constante (voir Mueller et Neuhauss, 2010).
- Enregistrement des mouvements oculaires
A l'image de champ clair de la tête du poisson a été introduit dans une caméra vidéo infrarouge. Éclairage infrarouge de poissons a été effectuée from ci-dessous. La caméra enregistre des images à une cadence de 5 images / seconde (larves) ou 12,5 images / seconde (adultes), respectivement. Les images sont automatiquement traitées, corrigées et lissés pour la forme des yeux. L'orientation des yeux par rapport à l'axe horizontal est alors déterminée automatiquement et la vitesse de l'œil a été calculée par le logiciel propriétaire. Petits mouvements du poisson ont été corrigées automatiquement par le logiciel. Tout d'enregistrement et d'analyse a été réalisée en temps réel.
3. Post-traitement des données expérimentales
- Mesures brutes de vitesses des yeux ont été filtrées pour saccades afin d'extraire la phase lente de la vitesse.
- Saccade-filtrés courbes de vélocité oculaires ont été lissées par une moyenne mobile avec une fenêtre glissante de 7 images.
- La vitesse des yeux a été en moyenne sur des cadres avec des conditions identiques de relance.
- Pour les larves de poissons, la vitesse de l'œil a été en moyenne sur les deux yeux.
4. Les résultats représentatifs:
Pour le poisson-zèbre larvaire, le mutant pare-chocs a été choisi. Dans ce mutant, les cellules épithéliales hyperproliferate lentille, ce qui conduit à la taille réduite de lentille et l'emplacement de la lentille ectopique. Ces altérations morphologiques se traduisent par une réduction significative de la sensibilité au contraste et l'acuité visuelle (Schönthaler et al., 2010). La figure 1 montre la différence de sensibilité au contraste des mutants pare-chocs contre de type sauvage frères et sœurs. Mutants pare-chocs de plus en plus ne parviennent pas à régler la vitesse de l'œil avec la diminution de contraste de relance. Par analogie, lorsque la fréquence de stimulation est augmentée spatiale, c'est à dire la largeur de bande de stimulation est réduite, de même pour voiture mutants démontrent baisse de l'acuité visuelle (Fig. 2)
La dépendance de l'adulte poisson zèbre visuaperformances l sur les conditions environnementales a été étudiée en soumettant le poisson à diverses concentrations d'alcool dans leur réservoir d'eau pendant 30 minutes, puis mesurer la réponse optocinétique dans des conditions différentes de relance. Le poisson zèbre adulte montrent une réduction marquée de la sensibilité au contraste lorsqu'elles sont maintenues à des concentrations croissantes d'alcool (Fig. 3). Une même dose-dépendante de réduction de la vitesse de l'œil d'ensemble sur une large plage de fréquences spatiales pu être observé lorsque les poissons ont été traitées avec des concentrations croissantes d'alcool (Fig. 4). Traitement de l'alcoolisme en outre dépendante de la dose réduit les performances oculomotrices à des tâches plus exigeantes comme l'illustre par des vitesses accrues de relance (Fig. 5).
Figure 1. Vitesse Zebrafish yeux des larves dépend Contrairement stimulus. 10 et 10 mutants pare-chocs de type sauvage frères et sœurs ont été analysés à 5 dpf s dans diverses conditions timulus contraste bande. Le graphique montre que la vitesse moyenne des yeux ± 1 écart-type.
Figure 2. Zebrafish oeil larvaire vitesse dépend de la fréquence spatiale. 10 et 10 mutants pare-chocs de type sauvage frères et sœurs ont été soumis à différentes largeurs de bande de relance à 5 dpf et analysé comme décrit. Le graphique montre que la vitesse moyenne des yeux ± 1 écart-type.
Figure 3. Zebrafish spectacle pour adultes dépendant de la concentration d'alcool dans la réduction de la sensibilité au contraste. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysées dans des conditions différentes de relance de contraste bande. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe témoin: n = 11).
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Figure 4. Zebrafish spectacle pour adultes dépendant de la concentration d'alcool dans le mouvement des yeux réduction globale sur une large gamme de largeur de bande de relance. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysées dans des conditions différentes de relance largeur de bande. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe témoin: n = 11).
Figure 5. Adultes montrent l'alcool Zebrafish dépendante de la concentration réduction des mouvements oculaires globale sur une large plage de vitesses de relance. Adult poisson zèbre ont été maintenus à des concentrations variables d'alcool comme il est indiqué pendant 30 minutes et analysés sous différentes conditions de vitesse de relance. Le graphique montre la vitesse moyenne temporelle oeil-à-nasal ± 1 SEM de 9 poissons par groupe (à l'exception du groupe de contrôle:n = 11).
Discussion
L'importance de l'OKR pour l'étude de la fonction visuelle a été reconnu dans la communauté scientifique pour une longue période (de Pâques et de Nicola 1996, 1997), et tente de quantifier réellement le paradigme ont bien commencé il ya une décennie. Pâques et Nicola (1996) a développé un système motorisé avec tambours rotatifs rayés, où l'enregistrement vidéo des mouvements oculaires ont été analysées manuellement. Ce système a souffert de l'absence d'immobilisation de l'embryon de poisson, qui a nécessité un repositionnement manuel fréquent, et peut détecter les mouvements de poursuite des yeux qu'avec grande difficulté. Un pas en avant a été l'utilisation d'un tambour vidéoprojetée rayé pour permettre plus de présentation informatique stimulus variable générée (Roeser & Baier, 2003;. Rinner et al, 2005a).
La essentiellement manuel, cadre-par-cadre analyse des enregistrements sur bande vidéo s'est avérée extrêmement laborieux, et, dans une certaine mesure, entravé par l'observateur biais (Beck et al.,2004). Analyse en temps réel a été proposé pour permettre l'utilisation de mécanismes d'apprentissage du comportement de rétroaction (Major et al., 2004). L'utilisation de l'éclairage infrarouge et la fréquence des stimuli contrôlés par rotation a été mis au point par Beck et al. (2004). Cependant, le système décrit il n'a été utilisé que pour les larves, et l'analyse a été réalisée hors ligne. En outre, la VisioTracker permet un contrôle total sur les stimuli, y compris changer le stimulus au cours de l'expérience, ce qui permet une plus grande souplesse et une influence sur le déroulement spontané de l'expérience. En outre, la création de relance numérique utilisé par le VisioTracker surmonté les problèmes mentionnés plus haut avec une accélération de la masse inerte d'un tambour de relance rayé (Beck et al., 2004).
Retenue par les larves de la méthylcellulose n'interfère pas significativement avec le mouvement des yeux et de ne pas avoir d'effets à long terme sur le bien-être du poisson zèbre. Les larves de poissons ont été avec succèsmaintenu intégré dans de la méthylcellulose pendant plusieurs jours, jusqu'à ce que l'apport d'oxygène par la peau devient insuffisante pour la demande augmente avec l'âge (Qian et al., 2005).
La méthode retenue poissons adultes est tout aussi facile sur l'animal. La courte durée de l'expérience, couplée avec la possibilité d'échanger rapidement l'animal d'essai pour une autre, ajoute encore aux aspects positifs de protection des animaux du système. Depuis les branchies sont continuellement rincé par l'eau, il est commode de pointe de l'eau avec un produit chimique de choix pour étudier son effet sur les mouvements des yeux et de la performance visuelle. De même, une expérience de wash-out peuvent être ajoutés sans avoir besoin de manipuler l'animal entre les expériences.
Bruit de pixel dans l'image vidéo a été minimisée par lissage des algorithmes du logiciel VisioTracker exclusive, ce qui permet des mesures très précises de la position des yeux et de la vitesse angulaire. En outre, afin de faciliter statistiqueanalyse, le logiciel filtre sur les mouvements saccadés qui se produisent à une vitesse fixe et ne contribuent pas à l'état d'expérimentation. Une moyenne des courbes de vélocité plus de 7 images vidéo faciliter une analyse ultérieure.
Le VisioTracker ouvre une nouvelle dimension pour de nombreux domaines de recherche variés. Le système et ses prédécesseurs ont déjà été utilisées avec succès pour quantifier la performance visuelle chez les larves de poisson zèbre, en utilisant des paramètres tels que l'acuité visuelle, sensibilité au contraste et adaptation à la lumière (Rinner et al., 2005a, Schönthaler et al., 2010), pour l'analyse fonctionnelle des cônes photorécepteurs après manipulation des membres de la cascade de transduction visuelle (p. ex Rinner et al, 2005b, Renninger et al, 2011.)., ou l'analyse des défauts visuels chez les larves de poisson zèbre mutant (par exemple Schönthaler et al, 2005, 2008;. Bahadori et al., 2006). L'interdépendance de la maturation morphologique et fonctionnelle du système visuela été étudiée par des mesures OKR de montrer que l'acuité visuelle est principalement, mais pas tout à fait limitée par l'espacement des photorécepteurs au stade larvaire (Haug et al., 2010).
Le VisioTracker convient aussi bien pour analyser la fonction visuelle chez le poisson zèbre adultes et d'autres semblables espèces de poissons de taille moyenne (Mueller et Neuhauss (2010), le présent rapport).
Il est également envisageable d'utiliser le système de recherche dans des domaines tels que la toxicologie ou de pharmacologie dans lequel les substances à analyser peut être ajouté à l'écoulement de l'eau autour des branchies des poissons adultes. En outre, la polyvalence de VisioTracker permet des analyses plus approfondies, par exemple des ontogenetics de la fonction visuelle, la fonction des circuits neuronaux et le développement, ou sensori-moteur de commande (voir la revue dans Huang & Neuhauss, 2008).
Disclosures
Oliver DR Schnaedelbach et Holger D. Russig sont des employés de TSE Systems GmbH qui produit le système de suivi des performances visuelles utilisées dans cet article. La production de cet article a été parrainé par le TSE Systems GmbH. Stephan FC Neuhuass est un employé de l'Université de Zurich qui reçoit une rémunération par les systèmes de l'EST pour chaque système vendu.
Acknowledgments
KPM a été soutenu par l'UE FP7 (RETICIRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| Serum pipette | Greiner Bio-One | 612 361 | |
| VisioTracker | TSE Systems | 302060 |
References
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