Summary
滑液の高濃度の培養ヒト関節軟骨細胞の3次元システムについて説明する。滑液は関節軟骨のための最も自然な微小環境を反映し、容易に入手し、保存することができます。このシステムは、このように軟骨再生の研究や、関節炎を治療するための治療薬をスクリーニングするために使用することができます。
Abstract
軟骨破壊は、変形性関節症の中心的な病理学的特徴、米国における障害の主要な原因です。成人の軟骨は、 生体内で非常に効率的に再生成されません、そしてその結果として、変形性関節症は軟骨の損失を不可逆的につながると慢性的な痛みと不動の1,2が付属しています。軟骨組織のエンジニアリングは、組織機能を再生成し、復元するために有望な可能性を提供しています。この技術は、通常、結果として得られる3Dは、エンジニアリングの目標生体 3-6 に欠損部位に移植することができる生化学的および生体力学的に成熟した組織で、ある期間にわたってバランスのとれた培地で構築する天然または合成の足場と培養に播種した軟骨細胞を含む。軟骨細胞の成長とマトリックスの沈着のための最適な条件を達成することが軟骨の組織工学の成功に不可欠です。
北極でのネイティブ関節腔、軟骨の骨のウラル表面は滑液に包まれている。この透明で粘性のある流体には、無血管性の関節軟骨に栄養を提供し、軟骨細胞の代謝7,8にとって重要な成長因子、サイトカインや酵素が含まれています。さらに、滑液は主に分泌する2つの主要なコンポーネント、ヒアルロン酸とlubricin 9 10を通じて、軟骨表面の間に低摩擦の移動が容易になります。対照的に、軟骨培養組織は、最も頻繁に人工培地で培養される。これらのメディアは、おそらく軟骨細胞代謝を研究するための複数の定義された条件を提供することができますが、関節液は、最も正確に関節軟骨細胞が入って置かれての自然環境を反映している
確かに、滑液は、取得および保存するために容易であるという利点があり、多くの場合、定期的に体内で補充することができます。いくつかのグループが増殖するヒト、ウシ、ウサギおよびイヌcで滑液で培養液を補充しているhondrocytes、そのほとんどは滑液（20％以下）11月25日の唯一の低レベルを使用していました。鶏、馬と人間の軟骨細胞が滑液のより高い割合と培地で培養されているが、これらの培養システムは、2次元の26から28でした。ここでは、21日の期間にわたって滑液の割合が高く（最大100％）で、3Dシステムで培養ヒト関節軟骨細胞の我々の手法を提案する。そうすることで、我々は滑液の高粘度によって提示される主要なハードルを克服した。このシステムは、さらなるための自然環境を模倣するために軟骨のための自然環境を構成する2つの他の重要な要因（酸素張力および機械的荷重）29,30と組み合わせることができる3D設定で滑液中に人間の軟骨細胞を研究の可能性を、提供します。軟骨の成長。さらに、このシステムはまた、軟骨細胞の滑液の活性を測定するために使用し、開発するためのプラットフォームを提供することができます軟骨再生技術や関節炎の治療オプション。
Protocol
滑液の培養ヒト関節軟骨細胞用3Dシステム
本研究では、我々は、修正された製造元で推奨されるカプセル化プロトコル（ロンザ、および31）を用いてアルギン酸ビーズで人間の関節軟骨細胞をカプセル化。これらの3次元構造体を使用して、我々は人間の滑液の様々な割合を含有する培養培地で細胞を培養するためのシステムを開発し、軟骨の遺伝子発現のためのこれらの3次元構造を評価している。
1。三次元（3D）カプセル化のためのヒト関節軟骨細胞（HAC）を準備
- 37 1分間° Cの水浴中で人間の関節軟骨細胞（HAC）（ロンザ）（パッセージ2）のバイアル（1ml）を解凍。
- 軟骨細胞増殖培地（ロンザ）を1mlと混合し、細胞を収集するために3〜5分間3000rpmで遠心する。上清を捨てる。
- 軟骨細胞増殖培地に再懸濁し、細胞ペレット（ロンザ）。
- 10cmの組織で細胞をプレート培養プレート（BD Biosciences社）、および軟骨細胞増殖培地で培養（ロンザ）細胞がコンフルエントになるまで。日立空調は3または4（P3またはP4）よりも高い継代数で使用してください。
- アルギン酸ビーズのカプセル化のために細胞を収集するtrypsinzation続いて、155ミリNaClの代わりに、標準PBSでプレート上に日立空調を洗浄してください。一度細胞が切り離されて、5分間3000rpmの時に細胞をスピンダウン。細胞は、今の3Dカプセル化するための準備が整いました。
2。 3Dビーズに日立空調をカプセル化
8 × 10 5細胞/ mlの密度で1.2％のアルギン酸塩溶液（シグマ）で日立空調を再懸濁します。細胞数は、スタンダードセルのカウンタを使用して、前のカプセル化に決定した。それは、ビーズの細胞の均等な分配を確保するためによく混合することは非常に重要です。
- ピペット22ゲージ針（タイコヘルスケア、（株））に接続された12mlのシリンジにHAC /アルギン酸塩溶液の混合物。
- 一方、102メートルと50 mLのビーカーを用意するボリュームでM CaCl 2を 5回HAC / aginateソリューションのこと。ビーカー内の攪拌棒を配置して（約150rpmで）徐々に102 mMのCaCl 2溶液をかき混ぜる。
- CaCl 2溶液の表面に上記の6インチ約シリンジの先端を保持し、CaCl 2溶液の滴下にHAC /アルギン酸塩混合物を追加。一般的に、結果として得られるアルギン酸ビーズは、約10 4細胞/ビーズのカプセル化の密度と直径で2mmです。注：CaCl 2溶液上にシリンジの高さが重要である。短い距離は、不均一な機械的完全性と細胞のカプセル化を引き起こし、球状ビーズの代わりに、形のティアドロップになります。
- ビーズは、20〜25分のCaCl 2溶液に撹拌してみましょう。他のアルギン酸カプセル化プロトコルは、10分の非常に短いインキュベーション時間を示す一方で、我々は、CaCl 2溶液と長いインキュベーション時間がなるの整合性を高めることを発見広告。
- CaCl 2溶液を除去する、軟骨細胞分化培地（ロンザ）で一度して2-3倍のNaClの2-3量のビーズを洗浄し、。他のアルギン酸ビーズのカプセル化プロトコルは、上記の洗浄手順については、フィルタを使用して関与しながら、我々は、アルギン酸ビーズはしばしばこのようにカプセル化の効率を減少させる、フィルターとドライアウトに閉じ込められることがわかった。我々はそれが最も効率的なビーズが廃棄するまでビーカーの底に解決を解決できるようにすることがわかった。
- 培養皿にビーズを転送する標準的なヘラを使用してください。通常、我々の文化軟骨細胞は、それらが滑液と軟骨細胞分化培地（ロンザ）に切り替える前に増殖させた培地でカプセル化のプロセスに適応できるように、軟骨細胞増殖培地で2日間ウェル3 cmあたり12のビーズを。
3。滑液の培養液で培養軟骨細胞
- 新鮮な滑液は、oから入手できます。utpatientクリニック（我々は、タフツ医療センターから滑液が得られる）。滑液は、実験室に15ミリリットルファルコンチューブに移し、そして直ちに細胞破片を除去するために15分間3000rpmで遠心分離することができます。一定分量の無細胞滑液1.5 mLのマイクロ遠心チューブに、凍結融解を避けるために。上清を-80℃で使用時まで保存することができます。
- 培養前にCaCl 2をこの微量がアルギン酸の整合性を確保するためである、100mMのアスコルビン酸の一定濃度で、体積比率を変化させることで、軟骨細胞分化培地（CDM、ロンザ）で滑液を混ぜると9ミリのCaCl 2（ビーズ）。
- 37℃インキュベーターで振盪プラットフォーム上でプレートを保持（ロッキング周波数：約75回/分）アルギン酸ビーズ内に栄養分布を手助けするために、ビーズの凝集を軽減する。これは長期間（最長4週間）のために我々は文化これらの軟骨細胞をとして特に重要です。 （注）：軟骨細胞の増殖と分化のメディア（ロンザ）は2つの一般的に使用される抗生物質ゲンタマイシン、アムホテリシンを含んでいますが、我々は軟骨細胞を培養するための滑液中の別の割合を使用していた抗生物質を補足していない。の汚染はこれまで観察されなかった。
- すべての2〜3日メディアの混合物を変更する。滑液の粘度は、長期培養中にアルギン酸ビーズ内にカプセル化された培養軟骨細胞における大きなハードルとなっています。我々はまた、アルギン酸ビーズの整合性を強化付き102mmのCaCl 2（50％V / V）、と滑液添加培地を希釈することが最も効果的な発見。このように、培地を徐々にビーズを傷つけることなく、ピペットで除去することができます。
4。遺伝子発現解析のためのアルギン酸ビーズの収穫の日立空調
遺伝子発現解析のためのアルギン酸ビーズから日立空調を収穫するときに特別な注意が必要です。
- アルギン酸ビーズ3 Tiを洗う約5分間ずつで102 mMのCaCl 2でのMES。
- 4-5回そのビーズの体積で55 mMのNaCitrateを追加することにより、軟骨細胞を取得する。アルギン酸ビーズが完全にNaCitrate溶液に浸漬されていることが重要です。振ったり、20〜30分の岩。
- 細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。
- RT - PCR解析のために、細胞溶解緩衝液（キアゲンRNA単離キット）で細胞ペレットを再懸濁し、そしてRNAの精製に進みます。
5。組織学的分析のためにアルギン酸ビーズの日立空調を修正
特別なケアは、組織学的分析のための3Dビーズから日立空調を収穫するために取られる必要があります。
- アルギン酸ビーズを約5分間ずつで102 mMのCaCl 2で 3回洗浄する。完全に粘性滑液を洗い流すために、我々は、37℃インキュベーター（ロッキング周波数で揺動、一晩軟骨細胞分化培地（ロンザ）で洗浄することが最も効果的な発見：約75時間秒/分）。軟骨細胞増殖培地は、この長期にわたる洗浄の軟骨細胞の生存を確保し、固定剤の最大の浸透を可能にするために使用されていました。
- 一晩70％エタノールでビーズを固定し、組織学的分析を進める。 DAPI染色を実行するには、穏やかな振盪下1時間のためにDAPI溶液（500ng/ml）をアルギン酸ビーズをインキュベートし、15分間付き102mm CaCl 2を各時間で3回洗浄する。 DAPI画像はその後、蛍光顕微鏡で観察することができます。ビーズはまた、アルシアンブルーとH＆E染色用切片にすることができます。
6。代表的な結果
滑液の高い割合で、人間の軟骨細胞のための私達の3次元培養法は、図1に示す模式図に描かれています。人間の軟骨細胞をアルギン酸ビーズ中にカプセル化された後、彼らは滑液の比率を変えて添加した培地で増殖させた。ために滑液の粘度が、それは不可欠です軟骨の構造の凝集を防ぎ、栄養素の均一な分布を確保するために一定の揺動条件下での培養軟骨細胞。それは、固定または溶解バッファーは、（図1）ビーズを貫通できるように、軟骨細胞を取得する前に広範囲にアルギン酸ビーズを洗浄するためにも不可欠です。アルギン酸ビーズ中の軟骨細胞の明視野（BF）画像をFig.2に示します。 DAPI染色は、ビーズ（図2）内のセルのusniform分布を確認するために実施した。 21日間の培養期間の終了時に、遺伝子発現解析は、定量RT - PCRによって行った。リファレンス遺伝子GAPDHは、それが軟骨細胞32上のqPCR解析のための最も信頼できるリファレンス遺伝子の一つであると決定されたとして、すべてのPCR反応のために正規化のために使用されていました。例を図に示します。我々は変形性関節症患者6例からプールされた滑液で培養したヒト関節軟骨細胞からの結果を分析した3。事実と一致することから軟骨細胞ロンザは必然的に脱分化33につながる2次元の文化、で展開されている、我々は、0日目軟骨細胞は軟骨基質遺伝子の最小限のレベル（図3）を発現しています。滑液を補充した軟骨細胞分化培地（ロンザ）または培地で軟骨細胞の3次元培養では有意に21日目（図3）34での再分化軟骨細胞を示すコラーゲン、アグリカンとMMP13、の軟骨の遺伝子発現を増加させた。メディアにおける滑液の割合を増やすと、軟骨基質のマーカーコラーゲンIIとアグリカンのmRNA発現（Fig.3Aおよび3B）の同等のレベルになりました。培地のみ（図3c）の培養と比較してさらに、100％滑液で培養した軟骨細胞は、さらに軟骨分解酵素MMP13のmRNA発現の減少を示した。興味深いことに、細胞死インジケータカスパーゼ3の発現レベルは徐々に示唆し、滑液の増加比で減少しているのynovial液体培養では減少アポトーシスレベル（図3D）につながっている。したがって、我々の結果は、3D設定の滑液中に高レベルの培養ヒト関節軟骨細胞は、実現可能な技術であることを示している。
テーブルと図
図1 3Dアルギン酸ビーズの滑液の割合が高いの文化、ヒト関節軟骨細胞への法の模式図。最初に、軟骨細胞およびアルギン酸塩溶液を混合されています。 CaCl 2溶液に滴下適用された場合、軟骨細胞は、架橋のCa -アルギン酸ハイドロゲルビーズ内に固定されています。これらの3次元構造は、ヒト滑液の比率を変化させた軟骨細胞分化培地（ロンザ）で培養されています。ロッキング条件下で培養21日後、細胞を含むアルギン酸ビーズは細胞が遺伝子のために取得された後に洗浄されています発現解析。
図2。ブライトフィールド（BF）およびヒト関節軟骨細胞のDAPI画像0％、30％、50％、70％と100％滑液とカプセル化された文化。軟骨細胞は、すべての培養条件で形状が球形であった。明視野（BF）およびDAPIの画像は、軟骨細胞の位置と分布を確認するために重ねていた。インセット、拡大画像。矢尻、BFとDAPI染色像における軟骨細胞の局在。
図3。一日でカプセル化されたヒト関節軟骨細胞の定量RT - PCR解析0（D0）滑液（SF）（0％、30％、50％、70の様々な比率で添加した培地で培養する（D21）の21日後に％と100％）。つの独立したサンプルの結果がここに表示されます。 GAPDHは、すべてのPCRのための内部基準として使用されていました。
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Discussion
このレポートでは、我々は人間の滑液の高濃度を含む培地で、3D環境でのヒト関節軟骨細胞の培養を可能にする方法を開発した。滑液は関節軟骨細胞が存在する関節腔、自然環境を構成する主要コンポーネントの一つです。しかし、滑液の粘度は、軟骨細胞の三次元の長期培養するための大きな課題となっています。粘性環境での3D構造でさえ栄養分布を維持するための課題を克服し、凝集を防ぐために、我々は、穏やかな揺れで一定の動きの下に軟骨の構成要素を配置する。軟骨の構成要素の構造的完全性を高めるために、我々はビード形成とメディアを変える手順31の時間の長さの最適化を含むアルギン酸ハイドロゲル中に軟骨細胞を播種の伝統的な手順を修正。とき、そのような手続きが不可欠である軟骨の構造は、長期培養中に粘性滑液で処理されます。
我々は、この方法は、私たちは彼らの自然なmilleu、滑液中のヒト関節軟骨細胞の生物学を勉強できるようになると考えています。つの潜在的な懸念は、試薬の拡散は、アルギン酸ビーズ中にカプセル化し、粘性のある環境で育った軟骨細胞のための理想的でないかもしれないことである。このように軟骨上の特定の試薬の効果を研究するために、より良い拡散はアルギン酸ビーズのサイズを減らすことによって、および滑液に試薬の配布を容易にする灌流システムを使用することによって達成することができる。私たちの代表的な結果は変形性関節症の患者由来の滑液で培養正常ヒト軟骨細胞から得られた一方で、我々は、このメソッドはそうでない健康な人や他の健康な脊椎動物の動物から滑液を使用するために外挿できると考えています。滑液の活性は、コンビナトリアル活動に相関させることができるので、流体中に存在する多くの生化学的要因の関係、私たちのシステムにおける軟骨細胞の遺伝子発現に対する滑液の正味の効果は、疾患の重症度と相関することができ、最終的に私たちは治療前と後の関節内環境を理解しておくと便利です。さらに、我々の手法はまた、個別に調整されて関節軟骨を再生させる培養自家軟骨細胞のために患者自身の滑液を使用しての可能性につながる可能性があります。この目的を達成するために、このシステムは、よく35として軟骨に滑液を介して作用する生体力学的力を研究するについての洞察を提供することがあります。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
我々は、滑液の貯蔵及び遠心分離のヘルプを提供するためのロビンナイ（タフツ医療センター）、智也内村とダナケアンズ（タフツ大学）に感謝いたします。この作品は、LZのためのNIH（1R01AR059106 - 01A1）によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
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