Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

Published: January 31, 2012 doi: 10.3791/3587
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cellular Biology, Tufts University School of Medicine, 2Department of Rheumatology, Tufts Medical Center

Summary

מערכת 3D של האדם culturing chondrocytes במפרק ברמות גבוהות של נוזל סינוביאלי מתואר. הנוזל הסינוביאלי משקף את microenvironment הטבעי ביותר עבור הסחוס במפרק, וניתן להשיג בקלות ומאוחסנים. מערכת זו ולכן יכול לשמש ללימוד התחדשות הסחוס ועל הרפוי ההקרנה לטיפול בדלקת מפרקים.

Abstract

הרס הסחוס היא תכונה מרכזית פתולוגי של דלקת מפרקים ניוונית, הסיבה המובילה למוגבלות בארה"ב. הסחוס הבוגר אינו מחדש ביעילות רבה in vivo, וכתוצאה מכך, דלקת מפרקים ניוונית גורמת לאובדן בלתי הפיך סחוס מלווה כאבים כרוניים 1,2 תנועה. הנדסת רקמות סחוס מציעה פוטנציאל מבטיח להתחדש ולשחזר תפקוד הרקמה. טכנולוגיה זו כרוכה בדרך כלל chondrocytes זריעת לתוך פיגומים טבעי או סינתטי culturing 3D וכתוצאה מכך לבנות בינוני מאוזן על פני תקופה של זמן עם מטרה של הנדסת רקמות ביוכימית ובוגרת biomechanically כי ניתן להשתיל לתוך האתר פגם in vivo 3-6 . השגת מצב אופטימלי לצמיחה chondrocyte בתצהיר מטריצה ​​היא חיונית להצלחה של הנדסת רקמות הסחוס.

ב סחוס חלל יליד משותף, בבית ארטיקתואר בלבד משטח עצם טובל הנוזל הסינוביאלי. זה נוזל שקוף וצמיג מספק חומרים מזינים הסחוס במפרק avascular והוא מכיל גורמי גדילה, ציטוקינים ואנזימים חשובים לחילוף חומרים chondrocyte 7,8. יתר על כן, נוזל סינוביאלי מאפשר חיכוך נמוך התנועה בין משטחי הסחוס בעיקר באמצעות הפרשת שני מרכיבים מרכזיים, ואת hyaluronan lubricin 9 10. לעומת זאת, הסחוס ורקמות מהונדסים תרבותי לרוב בתקשורת מלאכותית. בעוד כלי התקשורת הללו עשויים לספק תנאים מוגדרים יותר לחקר מטבוליזם chondrocyte, נוזל סינוביאלי ביותר ומשקפת את הסביבה הטבעית של chondrocytes במפרק אשר מתגוררים בה

ואכן, נוזל סינוביאלי יש את היתרון של להיות קל להשיג חנות, לעתים קרובות ניתן מתחדש באופן קבוע על ידי הגוף. כמה קבוצות יש להשלים את המדיום תרבות עם נוזל סינוביאלי בגידול האדם ארנב, שור והכלב גhondrocytes, אך משמש בעיקר רק רמות נמוכות של נוזל סינוביאלי (מתחת ל 20%) 11-25. בעוד chondrocytes, עוף סוס האדם כבר בתרבית בינוני עם אחוז גבוה יותר של נוזל סינוביאלי, מערכות אלה התרבות היו דו מימדי 26-28. כאן אנו מציגים את השיטה שלנו של כונדרוציטים culturing האדם במפרק במערכת 3D עם אחוז גבוה של נוזל סינוביאלי (עד 100%) על פני תקופה של 21 ימים. בעשותו כן, התגברנו משוכה העיקריים שהוצגו על ידי צמיגות גבוהה של נוזל סינוביאלי. מערכת זו מספקת את האפשרות ללמוד chondrocytes האדם הנוזל הסינוביאלי בסביבה 3D, אשר יכול להיות משולב עם עוד שני גורמים חשובים אחרים (מתח חמצן טעינה מכני) 29,30 המהווים את הסביבה הטבעית של הסחוס לחקות את הסביבה הטבעית סחוס הצמיחה. יתר על כן, מערכת זו יכולה לשמש גם עבור assaying פעילות הנוזל הסינוביאלי על chondrocytes ולספק פלטפורמה לפיתוחסחוס התחדשות טכנולוגיות אפשרויות טיפוליות עבור דלקת פרקים.

Protocol

מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי

בעבודה זו, אנו במארז chondrocytes במפרק האדם חרוזים אלגינט באמצעות ייצור שונה, הציע אנקפסולציה פרוטוקול (Lonza, ו 31). באמצעות אלה בונה 3D, פיתחנו מערכת של תאים culturing במדיום תרבות המכיל אחוזי מגוונת של נוזל סינוביאלי אנוש העריכו אלה בונה 3D עבור ביטוי גנים הסחוס.

1. הכן chondrocytes במפרק האנושי (HAC) אנקפסולציה (3D) תלת מימדי

  1. הפשירי בקבוקון (1 מ"ל) של כונדרוציטים במפרק האנושי (HAC) (Lonza) (מעבר 2) ב 37 ° C אמבט מים במשך דקות 1.
  2. מערבבים עם 1ml של התקשורת צמיחה chondrocyte (Lonza) ו צנטריפוגות בסל"ד 3000 3-5 דקות כדי לאסוף את התאים. בטל supernatant.
  3. Resuspend תא גלולה בתקשורת צמיחה chondrocyte (Lonza).
  4. פלייט תאים ברקמות 10 ס"מצלחת תרבות (BD Biosciences), והתרבות בתקשורת צמיחה chondrocyte (Lonza) עד התאים ומחוברות. HACs יש להשתמש במספר המעבר לא יותר מאשר 3 או 4 (P3 או P4).
  5. לשטוף HACs בצלחת בקוטר 155 מ"מ עם NaCl במקום PBS סטנדרטי, ואחריו trypsinzation לאסוף תאים אנקפסולציה אלגינט חרוז. ברגע תאים מנותקים, ספין למטה את התאים ב 3000rpm עבור 5min. התאים מוכנים כעת אנקפסולציה 3D.

2. לתמצת HACs לתוך חרוזים 3D

Resuspend HACs בפתרון אלגינט 1.2% (Sigma) בצפיפות של 5 8x10 תאים / מ"ל. מספרים סלולריים נקבעו לפני אנקפסולציה, באמצעות דלפק תא רגיל. חשוב מאוד לערבב היטב על מנת להבטיח אפילו חלוקת התאים החרוזים.

  1. פיפטה HAC / פתרון אלגינט התערובת לתוך מזרק 12 מ"ל מצורף מחט 22-מד (Tyco הבריאות, Inc).
  2. בינתיים, להכין כוס 50 מ"ל עם 102 מ 'M CaCl 2 בהיקף 5 פעמים כי הפתרון HAC / aginate. מניחים פס ומערבבים פנימה כוס ו לבחוש 102 mM CaCl 2 פתרון לאט (בסל"ד כ 150).
  3. החזק את קצה המזרק על 6 סנטימטרים מעל פני השטח של הפתרון CaCl 2 ומוסיפים את תערובת HAC / אלגינט לתוך dropwise 2 CaCl פתרון. באופן כללי, חרוזים אלגינט וכתוצאה מכך הם בקוטר 2 מ"מ עם צפיפות אנקפסולציה של כ 10 4 תאים / חרוז. הערה: גובה המזרק על פתרון 2 CaCl חשוב. מרחק קצר תגרום נפתח בצורת דמעה במקום חרוזים בצורת כדורי, גרימת שלמות מכני אחיד אנקפסולציה התא.
  4. בואו החרוזים ומערבבים בפתרון CaCl 2 דקות 20-25. בעוד אחרים אנקפסולציה פרוטוקולים אלגינט מצביעים על זמן דגירה קצרה בהרבה של 10min, מצאנו כי זמן דגירה ארוך עם פתרון 2 CaCl משופרת על שלמות להיותמודעות.
  5. הסר את הפתרון CaCl 2, לשטוף את חרוזים 2-3 פעמים 2-3 כרכים של NaCl, ואז פעם אחת בינוני בידול chondrocyte (Lonza). בעוד אחרים חרוז אלגינט פרוטוקולים אנקפסולציה לערב באמצעות מסנן עבור הנהלים כביסה לעיל, מצאנו כי חרוזים אלגינט נעשים לעתים קרובות לכודים את המסנן יבש, ובכך להקטין את היעילות של אנקפסולציה. מצאנו את זה היעילה ביותר כדי לאפשר החרוזים להתיישב לתחתית הכוס לפני השלכת הפתרון.
  6. השתמש מרית תקן להעברת חרוזים לתוך כלים התרבות. אנחנו בדרך כלל 12 חרוזים תרבות לכל 3 ס"מ גם עבור 2 ימים במדיום הגידול chondrocyte לאפשר chondrocytes להסתגל לתהליך אנקפסולציה במדיום הם גדלו לפני המעבר בינוני בידול chondrocyte (Lonza) עם הנוזל הסינוביאלי.

3. תרבות chondrocytes במדיום נוזל סינוביאלי תרבות

  1. הנוזל הסינוביאלי טריים ניתן להשיג oמרפאה utpatient (קיבלנו נוזל סינוביאלי מן המרכז הרפואי טאפטס). הנוזל הסינוביאלי ניתן להעביר צינורות 15ml בז למעבדה, ואת centrifuged מיד 3000 סל"ד במשך 15 דקות כדי להסיר את פסולת התא. Aliquot תא ללא נוזל סינוביאלי לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל, כדי למנוע חזרה להקפיא הפשרה. Supernatant ניתן לאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
  2. לפני culturing, לערבב את נוזל סינוביאלי עם בידול בינוני chondrocyte (CDM, Lonza) בשעה משתנים יחסי נפח, עם ריכוז קבוע של חומצה אסקורבית 100mm ו - 9 מ"מ CaCl 2 (סכום זה זכר CaCl 2 היא להבטיח את תקינותו של אלגינט חרוזים).
  3. שמור את הצלחת על פלטפורמה נדנדה 37 ° C חממה (תדר נדנדה: כ 75 פעמים / min) כדי לסייע הפצה מזין בתוך חרוזים אלגינט, ולהפחית clumping של החרוזים. זה חשוב במיוחד כאשר אנו תרבות chondrocytes אלה במשך תקופה ארוכה של זמן (עד 4 שבועות). פתק: למרות צמיחה chondrocyte ומדיה בידול (Lonza) מכילים שני סוגי אנטיביוטיקה נפוץ gentamycin ו amphotericin, אנחנו לא כל תוספת אנטיביוטיקה כאשר השתמשנו אחוז שונות של נוזל סינוביאלי עבור culturing chondrocyte. זיהום לא נצפתה מעולם.
  4. שינוי בתקשורת תערובות כל 2-3 ימים. הצמיגות של הנוזל הסינוביאלי כבר משוכה גדולה chondrocytes culturing הגלום חרוזים אלגינט במהלך לטווח ארוך תרבויות. מצאנו את זה היעיל ביותר לדלל נוזל סינוביאלי בינוני בתוספת 102mm CaCl 2 (50% V / V), אשר גם מחזקת את היושרה של חרוזים אלגינט. בדרך זו, המדיום יכול לאט יוסר עם pipet, מבלי לפגוע חרוזים.

4. קציר HACs בחרוזים אלגינט ניתוח ביטוי גנים

טיפול מיוחד יש לנקוט כאשר קצירת HACs מן החרוזים אלגינט ניתוח ביטוי גנים.

  1. שטפו את החרוזים אלגינט 3 טיmes ב 102 mM CaCl 2 במשך כ 5 דקות בכל פעם.
  2. אחזר את chondrocytes ידי הוספת 55 NaCitrate mM בהיקף 4-5 פעמים כי החרוזים. חשוב כי חרוזים אלגינט שקועים לחלוטין בפתרון NaCitrate. Shake או רוק דקות 20-30.
  3. ספין מטה את התאים להתעלמות supernatant.
  4. לניתוח RT-PCR, resuspend התא גלולה במאגר תמוגה תא (Qiagen RNA הבידוד בערכה), ולהמשיך עם טיהור RNA.

5. תקן HACs בחרוזים אלגינט לניתוח היסטולוגית

טיפול מיוחד צריך להילקח לקצור את HACs מן החרוזים 3D לניתוח היסטולוגית.

  1. שטפו את החרוזים אלגינט 3 פעמים 102 mM CaCl 2 עבור כל פעם כ 5 דקות. כדי לחלוטין לשטוף את נוזל סינוביאלי צמיגה, מצאנו אותו היעיל ביותר כדי לשטוף עם בידול בינוני chondrocyte (Lonza) בן לילה, נדנדה תדר 37 ° C חממה נדנדה (: על 75 זמןs / min). מדיום הגידול chondrocyte שימש כדי להבטיח הישרדות chondrocyte בכביסה זה ממושך כדי לאפשר חדירה מקסימלית של הסוכן לתקן.
  2. תקן את החרוזים באתנול 70% בין לילה, וכדי להמשיך ניתוח היסטולוגית. כדי לבצע מכתים Dapi, דגירה חרוזים אלגינט עם Dapi פתרון (500ng/ml) עבור 1 שעות תחת נדנדה עדין ולשטוף עבור 3 פעמים עם 102mm CaCl 2 במשך 15 דקות בכל פעם. תמונות Dapi אז יכול להיות מתחת למיקרוסקופ ניאון. החרוזים יכול גם להיות מחולק על alcian הכחול ו-H & E מכתים.

6. נציג תוצאות

שיטה culturing 3D שלנו chondrocytes אדם באחוזים גבוהים של הנוזל הסינוביאלי מתואר בתרשים סכימטי שמוצג תמונה 1. לאחר chondrocytes האדם היו ארוזים בחרוזים אלגינט, הותר להם לגדול בינוני בתוספת משתנים יחסי של נוזל סינוביאלי. בגלל הצמיגות של הנוזל הסינוביאלי, זה הכרחיchondrocytes תרבות בתנאים נדנדה מתמדת כדי למנוע ובהצטברויות בונה סחוס כדי להבטיח אפילו הפצה של חומרים מזינים. חשוב גם לשטוף את החרוזים אלגינט בהרחבה לפני אחזור chondrocytes, כך לתקן או חיץ תמוגה יכולים לחדור את החרוזים (תמונה 1). מוארת (BF) בשדה תמונות של כונדרוציטים של חרוזים אלגינט מוצגים Fig.2. מכתים Dapi בוצעה לאשר הפצה usniform של תאים בתוך החרוזים (איור 2). בתום תקופת 21 הימים, תרבות, ניתוח ביטוי גנים בוצע על ידי qRT-PCR. הגן התייחסות GAPDH שימש נורמליזציה עבור PCRs כל, כפי שהוא היה נחוש בדעתו להיות אחד הגנים הפניה הכי אמין לניתוח qPCR על chondrocytes 32. דוגמה לכך היא באיור. 3, שם ניתחנו את תוצאות chondrocytes במפרק אדם בתרבית נוזל סינוביאלי ונקווה מתוך שישה חולים עם דלקת מפרקים ניוונית. בקנה אחד עם העובדה chondrocytes מLonza הורחבו בתרבויות 2D, אשר יוביל באופן בלתי נמנע בידול דה 33, מצאנו כי יום 0 chondrocytes הביעו רמות מינימלי של גנים סחוס מטריצה ​​(איור 3). Culturing 3D של כונדרוציטים בינוני עם בידול chondrocyte (Lonza) או בינוני בתוספת נוזל סינוביאלי הגדילה משמעותית ביטוי סחוס הגן של קולגן, aggrecan ו MMP13, אשר מציין chondrocyte מחדש על ידי בידול יום 21 (Fig.3) 34. הגדלת אחוז נוזל סינוביאלי בתקשורת הביא רמות דומות של סחוס מטריצה ​​סמנים קולגן השנייה ביטוי aggrecan mRNA (Fig.3A ו 3B). יתר על כן, chondrocytes בתרבית נוזל סינוביאלי 100% אפילו הציג ירידה סחוס משפיל MMP13 ביטוי אנזים ה-mRNA, לעומת אלה בתרבית בינוני בלבד (Fig.3C). מעניין לציין, את רמת הביטוי של מוות של תאים אינדיקטור caspase 3 בהדרגה ירדה עם הגדלת יחס של נוזל סינוביאלי, טוען כי sculturing נוזל ynovial הובילה לירידה ברמות אפופטוזיס (איור 3D). לכן, התוצאות שלנו מראות כי האדם culturing במפרק chondrocytes ברמות גבוהות של נוזל סינוביאלי בסביבה 3D היא טכנולוגיה אפשרית.

טבלאות ומספרים

באיור 1.
באיור 1. תרשים סכמטי של השיטה על התרבות האנושית chondrocytes במפרק באחוזים גבוהים של הנוזל הסינוביאלי בחרוזים אלגינט 3D. ראשית, chondrocytes פתרון אלגינט מעורבבים. כאשר מוחל ירידה מבחינת לפתרון CaCl 2, chondrocytes הם משותקים בתוך CA-אלגינט חרוזים crosslinked הידרוג'ל. מבנים אלה הם 3D תרבותי אז עם יחס משתנה של נוזל סינוביאלי האדם במדיום בידול chondrocyte (Lonza). לאחר 21 ימים של culturing בתנאי נדנדה, חרוזים אלגינט המכיל תאים נשטפים בהרחבה לאחר מכן התאים מאוחזרות עבור הגןהביטוי ניתוח.

באיור 2.
באיור 2. שדה מוארת (BF) ותמונות Dapi של כונדרוציטים במפרק האנושי בתרבויות במארז עם 0%, 30%, 50%, 70% ו 100% נוזל סינוביאלי. Chondrocytes היו כדורי בצורת בכל תנאי התרבות. תמונות של שדה בהיר (BF) ו Dapi היו מעולף כדי לאשר את המיקום והפצה של כונדרוציטים. ריבועי, התמונות המוגדלות. ראשי חץ, colocalization של כונדרוציטים של BF ותמונות Dapi מכתים.

באיור 3.
באיור 3. QRT-PCR ניתוח במפרק האנושי הגלום chondrocytes ביום 0 (D0) לאחר 21 ימים של culturing (D21) במדיום להשלים עם יחס משתנה של נוזל סינוביאלי (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % ו 100%). תוצאות של ארבע דגימות עצמאית מוצגים כאן. GAPDH שימש התייחסות פנימית עבור כל PCRs. B. Aggrecan ביטוי ה-mRNA. ג. MMP13 ביטוי ה-mRNA. ד. Caspase 3 mRNA הביטוי. משמעות סטטיסטיים הוערכה ליום 0 דגימות יום 21 דגימות של 0% ו 100% נוזל סינוביאלי (SF) culturing, באמצעות תוכנה INSTAT. * מציין p <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדו"ח זה, פיתחנו שיטה המאפשרת התרבות של כונדרוציטים במפרק האדם בסביבה 3D במדיום המכיל ריכוז גבוה של נוזל סינוביאלי האדם. הנוזל הסינוביאלי הוא אחד הרכיבים העיקריים המהווים את הסביבה הטבעית בחלל משותף, שבו מתגוררים chondrocytes במפרק. עם זאת, את הצמיגות של הנוזל הסינוביאלי כבר אתגר גדול עבור culturing לטווח ארוך תלת ממדי של כונדרוציטים. כדי להתגבר על האתגר של שמירה אפילו הפצה מזין ב צבירה מבנה בסביבה צמיגה ולמנוע 3D, שמנו בונה סחוס תחת תנועה מתמדת עם נדנדה עדין. כדי לשפר את השלמות המבנית של בונה סחוס, שינינו את הנוהל המסורתי של כונדרוציטים זריעת לתוך הידרוג אלגינט כולל אופטימיזציה של משך הזמן ליצירת חרוז הליך התקשורת המשתנה 31. נהלים כאלה הם חיוניים כאשרבונה סחוס מטופלות בנוזל סינוביאלי צמיג במהלך לטווח ארוך תרבויות.

אנו מאמינים כי שיטה זו תאפשר לנו ללמוד את הביולוגיה של כונדרוציטים במפרק האדם milleu הטבעי שלהם, הנוזל הסינוביאלי. דאגה אחת היא כי פוטנציאל דיפוזיה מגיב לא יכול להיות אידיאלי עבור chondrocytes הגלום חרוזים אלגינט גדל בסביבה צמיגה. כך ללימוד ההשפעה של חומרים כימיים מסוימים על הסחוס מהונדסים, פיזור טוב יותר עשוי להיות מושגת על ידי הקטנת גודל של חרוזים אלגינט, ועל ידי שימוש במערכות טפטוף כדי להקל על חלוקת מגיב בתוך הנוזל הסינוביאלי. בעוד תוצאה נציג שלנו התקבל chondrocytes culturing נורמלי האדם הנוזל הסינוביאלי נגזר בחולים עם דלקת מפרקים ניוונית, אנחנו מאמינים בשיטה זו ניתן להסיק להשתמש נוזל סינוביאלי מאדם בריאים או בעלי חיים בעלי חוליות אחרים בריאים. בגלל פעילות נוזל סינוביאלי יכול להיות בקורלציה עם פעילויותיו קומבינטוריתהקשרים של גורמים ביוכימיים רבים הנמצאים בנוזל, ההשפעה נטו של הנוזל הסינוביאלי על ביטוי גנים chondrocyte במערכת שלנו עשויה להיות בקורלציה עם חומרת המחלה ובסופו של דבר לעזור לנו להבין את הסביבה intraarticular לפני ואחרי טיפולים. יתרה מכך, השיטה שלנו עשויה גם להוביל האפשרות של שימוש הנוזל הסינוביאלי של החולה עצמו עבור chondrocytes culturing עצמיים לחדש את הסחוס במפרק כי הוא מותאם באופן אינדיבידואלי. לשם כך, מערכת זו עשויה לספק תובנות לומד את כוחות biomechanical הפועל באמצעות נוזל סינוביאלי על הסחוס מהונדסים, כמו גם 35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו שום דבר לגלות.

Acknowledgments

ברצוננו להודות רובין ניי (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura ודנה Cairns (Tufts University) למתן עזרה עם אחסון נוזל סינוביאלי ו צנטריפוגה. עבודה זו מומנה על ידי NIH (1R01AR059106-01A1) עבור LZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table of specific reagents and equipment:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Alginate (Alginic Acid sodium salt) Sigma-Aldrich A2158-250G 2.4% solution stored at 40°C
Calcium Chloride Dihydrate, Granular JT Baker A19339
Chondrogenic Growth media Lonza Inc. CC-3156 (base media)
CC-4409 (supplement)
Chondrogenic Differentiation Media Lonza Inc. CC-3226 (base media)
CC-4408 (supplement)
Human articular chondrocytes Lonza Inc. CC-2550
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542
RNeasy mini kit (for RNA extraction) Qiagen 74104
PCR reagents: SYBR-green Quanta Biosciences 95053-500
12 ml syringe Tyco Healthcare, Covidien 512852
22-Gague Hypodermic Needle Tyco Healthcare, Covidien 8881
Microscope Olympus Corporation IX71
Platform rocker Thermo Fisher Scientific, Inc. Vari-mix
Collagen IIa-forward 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’
Collagen IIa-reverse 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’
MMP13-forward 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’
MMP13-reverse 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’
Caspase 3-forward 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’
Caspase 3-reverse 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Centers for Disease Control and P. Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).
  2. Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data. Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).
  3. Chung, C., Burdick, J. A. Engineering cartilage tissue. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).
  4. Glowacki, J. In vitro engineering of cartilage. J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).
  5. Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. 3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes. Tissue Eng. Part A. , (2009).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).
  7. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).
  8. Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. Cytokines in chronic inflammatory synovitis. Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).
  9. Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).
  10. Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression. Biochim. Biophys. Acta. , (2011).
  11. van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Biorheology. 37, 45-55 (2000).
  12. Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage. Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).
  13. Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro. Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).
  14. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis. Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).
  15. Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid. Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).
  16. Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis. Agents Actions. 26, 193-195 (1989).
  17. Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes. Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).
  18. Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).
  19. Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs. Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).
  20. Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid. J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).
  21. Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro. Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).
  22. Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis. Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).
  23. Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).
  24. Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture. J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).
  25. Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture. Arthritis Rheum. , (2011).
  26. Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro. Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).
  27. van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism. Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).
  28. Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).
  29. Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD. Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).
  30. Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals. Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).
  31. Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).
  32. Toegel, S., Huang, W., Piana, C. Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action. BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).
  33. Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation. J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).
  34. Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering. Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).
  35. Anat, J. 121, 107-118 (1976).

Tags

ביולוגיה של התא גיליון 59 chondrocytes מפרק נוזל אנושי סינוביאלי חרוז אלגינט תרבות 3D
מערכת 3D עבור chondrocytes culturing האדם במפרק של נוזל סינוביאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brand, J. A., McAlindon, T. E.,… More

Brand, J. A., McAlindon, T. E., Zeng, L. A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid. J. Vis. Exp. (59), e3587, doi:10.3791/3587 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter