Måling cellecyklusprogression Kinetics med metabolisk mærkning og Flowcytometri

Summary

Sporing små ændringer i progression og kinetikken af ​​cellecykluskinaser trin kan udføres ved anvendelse af en kombination af metabolisk mærkning af nukleinsyrer med BrdU og totalt genomisk DNA-farvning via propidiumiodid. Denne fremgangsmåde undgår behovet for kemisk synkronisering af delende celler, og derved forhindre indførelse af ikke-specifik DNA-skade, som igen påvirker cellecyklusprogression.

Abstract

Præcis kontrol af indledningen og den efterfølgende progression gennem de forskellige faser af cellecyklus er af afgørende betydning i prolifererende celler. Cellecyklus division er en integreret del af vækst og reproduktion og deregulering af centrale cellecyklus komponenter er blevet impliceret i den udløsende begivenheder carcinogenese ^1,2. Molekylære agenter i anti-cancer behandlinger ofte målrette biologiske veje, der er ansvarlige for regulering og koordinering af cellecyklus division ^3. Selv cellecykluskinetikken tendens til at variere efter celletype, fordelingen af ​​celler blandt de fire stadier af cellecyklen, er temmelig ensartet i en bestemt cellelinie skyldes konsistent mønster af mitogen-og vækstfaktor-ekspression. Genotoksiske begivenheder og andre cellulære stressfaktorer kan resultere i en midlertidig blokering af cellecyklus, hvilket resulterer i arrest eller en midlertidig pause i en bestemt celle cyklus fase for at tillade institutionergelse af en passende reaktion mekanisme.

Evnen til at eksperimentelt observere opførslen af ​​en cellepopulation med henvisning til deres cellecyklus fase er et vigtigt fremskridt i cellebiologi. Almindelige fremgangsmåder, såsom mitotiske ryste, differentialcentrifugering eller flowcytometri-baserede sortering anvendes til at isolere celler på specifikke stadier af cellecyklen ^4-6. Disse fraktionerede, cellecyklusinhibitorer fase-berigede populationer underkastes derefter eksperimentelle behandlinger. Udbytte, renhed og levedygtigheden af ​​de separerede fraktioner kan ofte blive kompromitteret ved hjælp af disse fysiske adskillelsesmetoder. Samt, kan tidsforskydningen mellem adskillelse af de cellepopulationer og starten af ​​eksperimentel behandling, hvor de fraktionerede cellerne kan udvikle sig fra den markerede celle cyklus fase, udgør store udfordringer i den vellykkede gennemførelse og fortolkning af disse eksperimenter.

Andre metoder til study cellecykluskinetikken trin omfatter anvendelsen af ​​kemikalier til at synkronisere celler. Behandling af celler med kemiske inhibitorer af vigtige metaboliske processer til hver celle cyklus trin er nyttige til blokering af progression af cellecyklus til det næste trin. For eksempel begrænser ribonucleotidreduktaseinhibitorforbindelser hydroxyurinstofforbindelser Standsningssteder celler ved G1 / S tidspunkt ved tilførsel af deoxynukleotider, byggestenene i DNA. Andre bemærkelsesværdige kemikalier omfatter behandling med aphidicolin, en polymerase alpha inhibitor for G1 arrestation behandling med colchicin og nocodazol, som begge interferere med mitotiske spindel dannelse standse celler i M-fasen, og endelig behandling med DNA kædeterminator 5-fluorodeoxyridine initiere S-fase arrest ^7-9. Behandling med disse kemikalier er et effektivt middel til synkronisering af en hel population af celler i en bestemt fase. Med fjernelse af de kemiske, genforenes celler cellecyklussen i fællesskab. Behandling af testmidlet følgende frigivelsefra cellecyklussen blokerende kemisk sikrer, at lægemidlet, der fremkaldes er af en ensartet, cellecyklus fase-specifik population. Men er da mange af de kemiske synchronizers kendte genotoksiske forbindelser, driller hinanden deltagelse af forskellige modforanstaltninger veje (til synchronizers versus test agenter) er udfordrende.

Her beskriver vi en metabolisk mærkning fremgangsmåde til efter en subpopulation af aktivt delende celler via deres progression fra DNA-replikation fase igennem til deling og adskillelse af de datterceller. Koblet med flowcytometri kvantificering denne protokol muliggør til måling af kinetiske progression af cellecyklus i fravær af enten mekanisk eller kemisk induceret cellulære understreger almindeligvis forbundet med andre cellecykluskinaser synkronisering metoder ^10. I de følgende afsnit vil vi diskutere metoden, samt nogle af dens anvendelser inden for biomedicinsk forskning.

Protocol

1. Cellepræparat

1. Plade celler for at opnå en densitet på cirka 60% konfluens. Cellerne skal være i log fase på tidspunktet for indsamlingen. For MCF7-celler, opnås dette ved at pode med 5 x 10 ⁵ celler / 10 cm plade i passende medier. HT29 og LS180-celler udsås på 6 x 10 ⁵ celler / 6 cm plade. Vi anvendte DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1 x penicillin / streptomycin. Sørg for at frø plader til de korrekte positive og negative kontroller iUd over dine prøver. De omfatter følgende:

Jeg	positiv kontrol	BrdU kun
ii	positiv kontrol	PI kun
iii	negativ kontrol	BrdU negativ, PI negativ

(Det skal bemærkes, at et indledende eksperiment med flere tidspunkter, såsom en skitseret i denne protokol kan bruges til at indsnævre tidsrammen under til at udføre fremtidige kollektioner.)

2. De udpladede celler inkuberes ved 37 ° C, 5% _CO2 i 24-48 timer, hvorved cellerne at genvinde og vedhæfte.
3. At pulsere label celler med bromdeoxyuridin (BrdU), der DMEM erstattes with frisk medium indeholdende 10 uM BrdU. Cellerne inkuberes i 1 time ved 37 ° C, _5% CO2 for at give mulighed for BrdU-inkorporering i DNA. Vær sikker på at efterlade en plade ubehandlet at fungere som den negative kontrol.
4. De puls-mærkning mediet fjernes, og cellerne blev skyllet kortvarigt med 1X PBS.
5. Friske vækstmedier tilsættes (minus BrdU) og cellerne får lov at fortsætte med at inkubere ved 37 ° C, _5% CO2, indtil den ønskede tidspunkterne for høstning er nået.

2. Høst og fiksering

1. Ubehandlede celler fra trin 1,3 betragtes som nul tidspunkt. Denne prøve kan høstes sammen med 1 time tidspunkterne, som er indsamlet umiddelbart efter BrdU behandling.
2. At høste cellerne, er mediet fjernet, og pladerne skyllet en gang med 1X PBS.
3. Celler trypsiniseret, opsamles i dyrkning medier og derefter pelleteret ved centrifugering ved 1500 rpm i 5 min Supernatant kasseres.
4. Skylning 1-10 x 10 ⁶ celler i 5 ml iskold 1X PBS. Centrifugeres ved 1500 rpm i 5 min Supernatanten bortkastes.
5. Cellepelleten resuspenderes derefter i 100 pi iskold PBS / 1% FBS. Tilsætning af 1% FBS i PBS hjælpemidler til forebyggelse celle sammenklumpning.
6. Tilføje disse celler dråbevis til 5 ml -20 ° C, 70% ethanol til fiksere cellerne.
7. Inkuber på is i 30 minutter eller opbevar ved 4 ° C natten over. Dette er en ideel løntrin, for at stoppe indsamling af prøver fra de forskellige tidspunkter. Prøverne kan efterlades i ethanol i adskillige dage, så de kan behandles samtidigt gennem den resterende del af protokollen.

3. BrdU og PI-farvning

1. Udpelleter cellerne ved centrifugering i 5 minutter ved 1500 rpm.
2. Fjerne fiksativ, men efterlader ~ 50 pi, som til at løsne pelleten ved hvirvelbehandling.
3. At denaturere DNA'et, tilsættes langsomt 1 ml 2N HCl / Triton X-100dråbevis under hvirvelbehandling. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 30 min.
4. Udpelleter cellerne ved centrifugering prøver i 5 minutter ved 1500 rpm. Aspirer og kassér supernatanten.
5. Resuspenderes cellebundfaldet i 1 ml 0,1 M natriumtetraborat, pH 8,5, for at neutralisere denatureringstrin.
6. Centrifugeres cellerne i 5 minutter ved 1500 rpm. Aspirer og kassér supernatanten.
7. Resuspenderes cellebundfaldet i 75 pi af BrdU-farvning blanding (50 ul 0,5% Tween 20/1% BSA / PBS + 20 ul FITC-konjugeret anti-BrdU + 5 ul 10 mg / ml RNase).
8. Inkuber ved stuetemperatur i 45 minutter beskyttet mod lys.
9. For at pelletere cellerne, prøverne centrifugeres i 5 min ved 1500 rpm. Aspirer og kassér supernatanten.
10. Resuspenderes cellebundfaldet i 1 ml PBS indeholdende 5 ug / ml propidiumiodid.

4. Flowcytometri

1. At analysere cellerne, et flow-cytometer er udstyret med en 488 nm laser ogpassende filtre er nødvendig. Analyse software som CellQuest er nødvendig for at skabe de plots skitseret nedenfor.
2. Når de kører prøven gennem flow-cytometeret, skaber en fremadrettet lysspredning (SSC-H) vs sidespredning (FSC-H) plot for at sikre den korrekte størrelse fordelingen af celler (figur 1A). Begge disse parametre afbildes på en lineær skala.
3. Samtidigt vist en afbildning af FL3-H (PI farve) vs FL2-W (figur 1B). Dette plot anvendes til at skabe en gate (R3) for at isolere den fraktion af celler, som er inden for den normale fordelingsmønster af cellecyklussen. I almindelighed er denne fordelingsmønster kendetegnet ved to klynger af celler fra 2N og 4N DNA-indholdet i PI-farvning repræsenterer G1 og G2-faser af cellecyklussen, hhv. En streng af celler placeret mellem disse 2 klynger er repræsentativ for løbende DNA-replikation, der forekommer i S-fasen af ​​cellecyklussen.
4. Opret et plot displaying af gatede celler (R3) fra trin 4.3, til FL1-H (FITC, log plot) på y-aksen og PI (lineær afbildning) på x-aksen (fig. 1C). Dette plot vil blive anvendt til at indstille de resterende parametre med de forskellige kontroller er beskrevet i 1.1, såvel som til at indsamle data til analyse.
5. Placer PI eneste farvede prøve på cytometret. Justere forstærkningen for at placere G1 på ~ 200 på x-aksen. Det vil være lettere at visualisere et histogram plot af PI pletten.
6. En anden kontrolgruppe indebærer at køre en BrdU-kun prøve på flowcytometer. Juster forstærkning, så de 2 populationer af celler (BrdU positive vs BrdU negative) vises på grunden. Ideelt er de BrdU-negative celler anbragt vises lige under 10 ^-1.
7. Den endelige kontrol er BrdU / PI negativ prøve. Kør denne negative kontrol for at sikre, at cellerne ikke vises i nogen af ​​de øverste eller højre hånd kvadranter.
8. Når parametrene for de forskellige grunde er indstillet,Flowcytometret kalibreres og klar til behandling af BrdU og PI farvede celler. Et minimum af 10.000 celler, der er gated i den korrekte PI fraktion (se trin 4.3) skal læses pr samling.
9. For at analysere de indsamlede data, software såsom FlowJo eller FacsDiva udnyttet. Hver af de ovennævnte grunde kan genskabes i disse programmer og kvantitativ og statistisk analyse.
10. Det endepunkt af analysen omfatter flere på hinanden følgende trin. Oprettelse af et plot af FITC vs PI med celler gatede som PI positivt fra PI vs FL2-W plot gør det muligt at skelne cykling befolkning. En anden port er skabt ud fra dette plot ved isolering af BrdU positive population. Udtrykke denne særlige population på et histogram plot med PI på x-aksen gør det muligt at spore tidsforløbet af cellecyklusprogression. Dette kan yderligere visualiseres ved at plotte antallet af BrdU-positive celler med G1-eller G2 indhold som en funktion af tiden.

5. Repræsentative resultater

Normalt delende celler farvet med propidiumiodid har distinkte toppe ved G1 og G2, der svarer til celler indeholdende 2N og 4N DNA-indhold, henholdsvis (fig. 2). Pulsmærkning med BrdU muliggør selektiv mærkning af et sub-population af celler, der aktivt syntetiserer DNA (dvs. S-fase). Kort efter fjernelse af BrdU reagens er alle mærkede celler i S-fase (Figur 3). Ved at begrænse mærkning af en kort impuls man er i stand til at følge denne nu tydelig sub-population af celler gennem adskillige tidspunkter, når de passerer gennem de efterfølgende faser af cellecyklussen. Dette kan visualiseres på en time tidspunkt i figur 3 som en udtalt mangel på G1-og G2 toppe.

Yderligere information kan afledes af BrdU-mærkning trin. Ikke blot kan andelen af ​​aktivt delende celler måles, men en estimate af cellecyklus fase fordeling mellem de to prøver kan bestemmes. Ved at indsamle celler ved jævnt fordelte intervaller efter fjernelse af BrdU reagens, kan celler spores, når de fortsætter med at cykle, fremskridt G2 og i sidste ende at bevæge sig gennem til-celle-deling af de originale celler, endelig fremstår som BrdU-positive datterceller med G1 DNA-indhold (figur 4). Et eksempel på cellecyklussen fase kvantificering og kinetisk analyse er tilvejebragt i figur 5..

Figur 1 (a) Forward Scatter kontra sidespredning Plot af en repræsentativ MCF7 cellepopulation. (B) PI versus bredde (FL-W) Plot af en repræsentativ MCF7 cellepopulation. Gating er vist at udelukke celler doubletter i den endelige analyse (R3). Celle dubletter vil have større impulsbredden end en enkelt celle, mens de tager længere tid til at passere gennem laserstrålen og therefmalm kan udelukkes fra analysen. (C) PI versus FITC (BrdU) Plot af en repræsentativ MCF7 cellepopulation. Gating er vist kun at inkludere de FITC (BrdU) positive celler (R4).

Figur 2. Repræsentant histogram afbildning af en samlet befolkning på normalt cykler celler.

Figur 3. Histogram afbildning af celler, der er blevet indsamlet 1H efter fjernelse af BrdU puls efter gating for FITC (BrdU)-positive celler. BrdU-positive celler på et tidligt tidspunkterne efter fjernelsen af ​​etiketten viser PI profiler, der svarer til prøverne udviser DNA-indholdet i overensstemmelse med celler, som er i S-fasen af ​​cellecyklussen, hvilket bekræfter den vellykkede mærkning af celler kun i DNA-syntese.

lt = "Figur 4" />
Figur 4. Sammenligning af cellecyklusprogression kinetik cancercellelinier, colorektale cancere HT29 (A) og LS180 (B) samt brystcancer MCF7 (C). Cellerne blev opsamlet hver time i 8 timer efter fjernelse af BrdU puls. I dette eksperiment, observerede vi en klar profil af accelereret cellecyklusprogression via G2-fasen af ​​cellens cyklus i colorektal cellelinie LS180. Sammenligning af de kinetiske mellem de to profiler af colorektale cancerceller, udviklingen af ​​en G1 top er tydeligt ved T = 4 h efter BrdU i LS180-celler, sammenlignet med det tilsvarende tidspunkt for HT-29 cellelinien, som mangler denne top. Sammenlignet med den ene af de to kolorektale cellelinjer, der MCF7-celler cykler med en væsentligt reduceret sats. Klik her for at se større figur .

Ad 5 "/>
Figur 5 (a) Kvantitativ cellecyklussen fase analyse af BrdU-mærkede cancerceller. Dekanen / Jett / Fox algoritme blev anvendt til HT29, LS180 og MCF7 (illustreret i grøn). De resulterende celle cyklus fase fordelinger fra hver prøve udtrykkes som% af total BrdU-positive celler i hver fase. Vælg kun tidspunkter for hver celle linie vises, som analyserne for nogle af de tidligere tidspunkter produceres ugyldige resultater. I disse tidligere tidspunkter, er alle BrdU-positive celler i S-fase og mangler derfor adskilt G1 og G2 toppe, som er nødvendige for algoritme anvendes. (B) Histogrammer af cancerceller viser kinetikken for progression gennem G2 / M faser af cellecyklussen. Progression gennem G2 / M faser er hurtigst til LS180 celler, efterfulgt af HT29 og MCF7. Klik her for at se større figur .

jpg "alt =" Figur S1 "/>
Figur S1. Flowcytometri kontroller. MCF7-celler er vist som (A) negativ kontrol, hvor celler er hverken PI eller BrdU farves. (B) PI farves kun. (C) BrdU-FITC-mærket prøver.

Figur S2. Skematisk illustration, der viser forholdet mellem fluorescensemissionsspektret PI versus FITC (BrdU). De spektrale indsamling vinduer fluorescerende kanal 1 (FL1 for FITC) og fluorescerende kanaler 3 (FL3 for PI) er vist i tilsvarende felter. Der er ingen fluorofor spektre overlapning mellem FL1 og FL3 afsløring. Åbenbart fluorescens erstatning ikke nødvendigt, når eksperimentelle data fra PI og FITC-BrdU co-mærkede celler opsamles i FL1/FL3 kanal. Fluorescens spektre blev opnået fra BD Biosciences hjemmeside:target = "_blank"> http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. Klik her for at se større figur .

Discussion

Ved at kombinere flowcytometri med BrdU inkorporering, har vi de nødvendige værktøjer til at undersøge celle cyklus kinetik. Den karakteristiske egenskab af BrdU at fungere som en thymidinanalogen er det muligt for DNA-indhold kvantificering af en cykel celle. Inkorporering af BrdU i en voksende datter DNA-streng under syntesen fase af cellecyklen, er det, gør det muligt at følge en subpopulation af delende celler ved replikation af DNA i S-fase, en periode af væksten ved G2 og i sidste celledeling . Datterceller BrdU-positive celler kan kontinuerligt fulgt indtil hvilket tidspunkt den BrdU mærkning fortyndes ved celledeling i den grad, hvor signalet reduceres til baggrundsniveauer.

Brug propidiumiodid til bestemmelse af total DNA indhold, vi er i stand til at følge cellecyklusprogression fra S → G2 / M → G1. Evnen til at spore den cykliske hastighed af celler er vigtig og nyttig ved mange anvendelser, især for præ-kliniske undersøgelser med cellecyklus-specifik DNA-skader inducerende lægemidler eller under udvikling af nye lægemidler til at bestemme cellecyklus fase følsomheden af nye forbindelser ^11. Den mest indlysende fordel ved anvendelse af en metabolisk mærkning teknik er fjernelse af kemiske synkronisering af celler. Da de fleste kemiske behandlinger, der inducerer cellecyklusstandsning selv genotoksiske kan dissekere cellecyklussen følsomhed virkninger af hidtil ukendte forbindelser i nærvær af disse kemikalier ikke er mulig.

Vi demonstreret alsidigheden af ​​dette BrdU metabolisk mærkning teknik med PI co-farvning. Anvendelse af denne protokol, har vi med succes vist, at stigningen i cellecyklusprogression via G2 / M-fasen af cellens cyklus kan observeres i telomerase-negative humane celler, som er blevet transformeret til at have tvunget enzymekspression ^10. Selv om denne fremgangsmåde er effektiv i at måle kinetikken for cellen, som det cyklusser throuf flere trin, en begrænsning er tabet af synkroniseringsinformation under overgangene, såvel som inden for G2-og M-faser. Som celler fortsætte gennem G2 til M, vi er i stand til at skelne ikke kun de to faser, men også sub-G1 befolkning, udelukkende baseret på DNA-indhold. I applikationer, hvor dette differentiering er påkrævet, er det potentielt muligt at co-plet BrdU-mærkede celler med antistoffer mod cycliner eller andre cellulære proteiner, hvis udtryk er specifikke for den ønskede fase af cellecyklussen ^12,13. Yderligere optimering vil være nødvendigt at sikre, at cyclin antistofferne er forenelige med BrdU mærkning og immunfarvning protokol. Ideelt set i tilstrækkelig skelne mellem de forskellige faser af cellecyklussen, kan adskillige cyclin antistoffer være nødvendigt at co-label en enkelt prøve samtidigt. Vores laboratorium arbejder på post-mærkning af BrdU-puls mærkede celler med cyclin B og fosfor histon 3-antistoffer til at skelne mellem celleri G2 versus M-fasen af ​​cellens cyklus. Co-mærkning med cyclin antistoffer foruden PI og FITC-BrdU-farvning væsentligt forøger komplikation af flowcytometri fra både hardware og dataanalyse (fluorescens erstatningsaspektet) perspektiv. Med fremkomsten af ​​den nye generation af flowcytometre bør fremskridt i deres kapacitet og funktionalitet afhjælpe disse tekniske problemer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bromodeoxyuridine	BD Biosciences	55089
propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	1mg/ml stock
FITC anti-BrdU	BD Biosciences	347583
sodium tetraborate	Fisher Scientific	S80172	0.1M, pH 8.5
FACS Caliber	BD Biosciences