Articolo metodologico

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 novembre 2012

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1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

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Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Abstract

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La perdita della vista colpisce circa 3,4 milioni di persone negli Stati Uniti e dovrebbe aumentare nei prossimi anni. 1 Recentemente, la terapia genica e trapianto di cellule staminali sono diventate fondamentali strumenti terapeutici per la cura della cecità derivante da malattie degenerative della retina. Diverse forme di trapianto autologo di età degenerazione maculare (AMD), come il trapianto di cellule del pigmento epiteliale dell'iride, hanno dato risultati incoraggianti, e studi clinici hanno iniziato ad altre forme di terapie geniche e cellulari staminali. 2 Questi includono RPE65 sostituzione del gene terapia in pazienti con amaurosi congenita di Leber e un trapianto di cellule RPE utilizzando umane staminali embrionali (ES) cellule nella malattia di Stargardt. 3-4 Ora che sono vettori di terapia genica e cellule staminali disponibili per il trattamento di pazienti con malattie retiniche, è importante verificare questi potenziali terapie in modelli animali prima di applicarezione in studi sull'uomo. Il mouse è diventato un importante modello scientifico per testare l'efficacia terapeutica di vettori di terapia genica e trapianto di cellule staminali negli occhi. 5-8 questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per iniettare vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico di l'occhio del mouse riducendo i danni al tessuto circostante.

Protocollo

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1. Montare dispositivi per l'iniezione sottoretinico

  1. Acquistare o fare un ago diametro 100 micron da un tubo capillare di vetro. Questo può essere fatto manualmente utilizzando un Sutter P-97 pipetta estrattore o altre apparecchiature simili. L'estremità del tubo capillare viene riscaldato e tirato fino a raggiungere il diametro desiderato (100 micron). Un ago di diametro più piccolo può essere utilizzato per vettori di terapia genica, tuttavia, questo è il diametro raccomandato per l'iniezione delle cellule senza danni alle cellule o l'occhio. Rispetto agli aghi di acciaio, l'ago capillare di vetro ha una punta molto fine, ma smussato,....

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Risultati

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Un disegno dell'occhio del mouse viene visualizzata con le strutture principali etichettati come riferimento, con le frecce che mostrano le posizioni per le procedure di iniezione sia intravitreali e sottoretinico chirurgici (punte di freccia, figura 1). Vettori di terapia genica, quali il vettore lentivirale lacZ (Figura 2), può essere iniettato usando queste posizioni. Inoltre, le cellule staminali di topo, come le cellule staminali embrionali (Figura 3),.......

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Discussione

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Questa tecnica video fornisce istruzioni su come completare la procedura chirurgica sottoretinico iniezione successo, e garantire che il vettore terapia genica o le cellule staminali sono collocati nella posizione necessaria per trattare efficacemente la malattia oftalmica. Questa tecnica permette di targeting di cellule retiniche quali la RPE o fotorecettori, in quanto pone i vettori per terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti in prossimità di queste cellule. I metodi precedenti coinvolti iniezioni intra.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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La ricerca per prevenire la cecità, l'assistenza sperimentale da Takayuki Nagasaki; Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva. KJW è supportato da sovvenzioni NIH 5T32EY013933 e 5T32DK007647-20. VBM è sostenuto da NIH sovvenzione K08EY020530.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome Azienda Catalogo Commenti
0,8-1,10 x 100 mm Tubo capillare (vetro) Kimble Glass, Inc. 34502 99
Flaming / Brown Micropipetta Puller Sutter Instrument P-97 Narishige microforgia può essere utilizzato in sostituzione. Catalog # MF-900
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-25ML Silicone
Fosfato Dubecco di soluzione salina tamponata con cloruro di calcio e cloruro di magnesio Gibco-Invitrogen 14040-133
Sicurezza-Lok 25 3/4G x 12 "; Imposta il prelievo di sangue BD Vacutainer 367298
1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Siringa Becton-Dickinson 309597
0,5-10 ul Finnpipette II-Volume regolabile pipettatura FISHERBRAND 21-377-815
1-200 ul Consigli naturali smussati USA Scientific, Inc. 1111-1700
Discovery.V8 Microscopio Stereo Zeiss MC1500
60 mm x 15 mm Stile trattato cellulare Dish polistirene Cultura Corning Incorporated 430166
Forbici Vännäs dritti Storz Ophthalmics E3383 S
Pinze curve Dressing con dentellature Delicate Storz Ophthalmics E1408
15 Tipo Coltello Microchirurgia Wilssu oftalmica Corp. 091204
Ketamina Ketaset III NADA # 45-290
Xylazina Lloyd Laboratories NADA # 139-236
Bupivacaina (Marcaine) AstraZeneca N / A
Buprenorfina Sigma Aldrich B9275

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....

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Tecnica di sclerotomiaago capillare di vetroiniezione di fluidocontropressionespazio sottoretinicoepitelio pigmentato retinico

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