Vi har utviklet en cellefusjon assay som kvantifiserer snare-medierte membran fusion hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase.
Interaksjonene mellom Snare (s oluble N-etylmaleimid-sensitive faktor en ttachment protein re ceptor) proteiner på vesikler (v-Snares) og på målet membraner (t-Snares) katalysere intracellulær vesicle fusjon 1-4. Reconstitution analyser er avgjørende for dissekere mekanismen og regulering av snare-mediert membran fusion 5. I en cellefusjon assay 6,7, er snare proteiner uttrykt ectopically på celleoverflaten. Disse "venda" Snare proteiner drive celle-celle fusion, viser at snarer er tilstrekkelig til å smelte cellemembraner. Fordi cellefusjon Forsøket er basert på mikroskopisk analyse, er det mindre effektivt når det brukes til å analysere flere v-og t-snare interaksjoner kvantitativt.
Her beskriver vi en ny assay 8 som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase. Tokomponenter av Tet-Off genuttrykksystem 9 brukes som en avlesning system: tetracyklin-kontrollerte transactivator (TTA) og en reporter plasmid som koder LacZ-genet under kontroll av tetracyklin-responselement (TRE-LacZ). Vi transfektere TTA inn COS-7 celler som uttrykker venda v-snare proteiner på celleoverflaten (V-celler) og transfektere TRE-LacZ i COS-7 celler som uttrykker venda t-snare proteiner på celleoverflaten (t-celler) . Snare-avhengige fusjon av de V-og T-celler resulterer i bindingen av TTA til TRE, den transkripsjonelle aktivering av LacZ og uttrykk for β-galaktosidase. Aktiviteten av β-galaktosidase er kvantifisert ved hjelp av en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm.
De vesikkel-tilknyttede membran proteiner (Vamps) er v-Snares som bor i ulike post-Golgi vesikulær avdelinger 10-15. Ved å uttrykke en Vamps, 3, 4, 5, 7 og 8 på samme nivå, sammenligner vi deres membran fusionaktiviteter ved hjelp av enzymatisk cellefusjon analysen. Basert på spektrometrisk måling, tilbyr denne analysen en kvantitativ tilnærming for å analysere snare-mediert membran fusion og for høy gjennomstrømming studier.
Den opprinnelige cellefusjon analysen 6 fastsetter snare-medierte cellefusjon hendelser ved fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en nyskapende analyse som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser ved aktivert uttrykk for β-galaktosidase og spektrometrisk måling. Ved hjelp av denne analysen, vi rutinemessig analyserer 15-20 v-og t-snare kombinasjoner i et enkelt eksperiment. Bruke flowcytometri å måle Snare uttrykk på celleoverflaten, titrere vi uttrykket nivåer av Vamps og sammenligne dere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av oppstart midler fra University of Louisville og CA135123 fra National Institutes of Health (til CH).
Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
pTet-Off | Clontech | K1620-A |
pBI-G | Clontech | 6150-1 |
lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |