Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.
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Articolo metodologico
Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L'utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi "girato" SNARE unità proteine fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente.
Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall'espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l'attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L'attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm.
Le vescicole associate proteine di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l'analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.
Protocollo
1. Cultura e transfezione cellulare
- COS-7 cellule vengono coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 4,5 g / l di glucosio e 10% di siero bovino fetale (FBS).
- Trasfezione plasmide è fatto con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen).
2. Analisi al microscopio di fluorescenza Expression SNARE della superficie cellulare
- Il giorno prima della transfezione, 3 × 10 4 cellule COS-7 sono seminate su sterili 12-millimetri vetrini (Fisher Scientific) contenuti in piastre da 24 pozzetti.
- Per v-celle in ciascun pozzetto, 0,25 microgrammi di plasmide che codifica tTA (pTet-Off, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg di plasmidi che esprimono capovolto vampiri.
- Per le cellule T in ogni pozzetto, 0,25 mg del plasmide codificante TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg ciascuno dei plasmidi che esprimono capovolte SNAP-25 e sintaxine 1 o 4.
- 24 ore dopo transfection, le cellule vengono fissate con 4% paraformaldeide in PBS + + (PBS supplementato con 0,1 g / l CaCl 2 e 0,1 g / l MgCl 2) per 10 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 30 min.
- Le cellule sono incubate per 1,5 ore con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali (neat supernatante di coltura di ibridoma).
- Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule vengono incubate per 1 ora con anticorpi secondari coniugati con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) alla diluizione di 1:500.
- Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule marcate sono montati in oro antifade Prolungare reagente (Invitrogen).
- Immagini confocali sono raccolti su un microscopio laser confocale Olympus scansione. Le immagini vengono elaborate con il software Adobe Photoshop.
3. Analisi FACS di espressione SNARE della superficie cellulare
- Il giorno prima della transfezione, 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
- 24 ore dopo la tradinsfection con la capovolto SNARE, pTet-Off e pBI-G plasmidi, le cellule vengono fissate con 1% paraformaldeide in PBS + + per 15 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 15 min.
- Le cellule sono incubate con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali per 60 min.
- Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono marcate con anticorpi secondari coniugati con FITC (diluizione 1:200) per 45 min.
- Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono raschiate le piastre con un raschietto cellulare.
- 15.000 cellule vengono analizzate usando un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). L'intensità di fluorescenza media di ciascun campione è ottenuta utilizzando il software CellQuest Pro.
4. Enzimatica cellulare Assay Fusion
- Il giorno prima della transfezione, 1,2 x 10 6 cellule COS-7 sono seminate in ogni 100 mm piatto di coltura di tessuti, e 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
- Per v-cellule, 0,5 - 5 mg ogni Flipped plasmide VAMP è cotransfected con 5 pg di pTet-Off nelle celle di ogni 100 mm piatto di coltura. Cellule di controllo sono co-trasfettate con il vettore vuoto pcDNA3.1 (+) e pTet-Off. Per impedire la N-glicosilazione di VAMPS 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 pg / ml) è incluso nel mezzo di coltura cellulare durante la trasfezione.
- Per cellule T in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti, 1 ug di capovolte SNAP-25 e plasmide pBI-G vengono cotrasfettate con 0,5 pg di plasmide o capovolto syntaxin1 0,05 pg di plasmide syntaxin4 capovolte.
- 24 ore dopo la trasfezione, le v-cellule sono staccate da piastre di coltura con l'enzima senza dissociazione cellulare Buffer (Invitrogen). Cellule staccati sono contate con un emocitometro e risospese in tampone HEPES DMEM supplementato con 10% FBS, 6,7 ug / ml e 0,67 tunicamicina mM DTT.
- 4,8 × 10 risospeso 5 V-cellule vengono aggiunti a ciascun pozzetto contenente già le cellule T.
- Ratto dopo 6, 12 o 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 , l'espressione di β-galattosidasi è misurata utilizzando il β-galattosidasi Sistema saggio enzimatico con tampone di lisi Reporter secondo le istruzioni del produttore (Promega). Brevemente, le cellule vengono lavate due volte con PBS e lisate in tampone di lisi Reporter. I lisati cellulari sono mescolati con un volume uguale di tampone di saggio 2 ×. Come un controllo in bianco, il tampone di lisi Reporter viene miscelato con il tampone del saggio 2 ×.
- Dopo 90 minuti, la reazione colorimetrica viene bloccata per aggiunta di carbonato di sodio 1 M.
- Assorbanza a 420 nm viene misurata mediante spettrofotometro HITACHI 100-40.
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Risultati
Per sviluppare un saggio quantitativo fusione cellulare, approfittiamo del forte attivazione trascrizionale dal legame di tTA a TRE. In assenza di tTA, trascrizione del gene LacZ in TRE-LacZ è silenzioso. Quando tTA è presente, si lega al TRE e attiva la trascrizione di LacZ. Figura 1 mostra un diagramma di flusso del saggio enzimatico fusione cellulare. tTA viene transfettato in v cellule che esprimono v-SNARE proteine sulla superficie cellulare, e TRE-LacZ viene t...
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Discussione
Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espres...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l'Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente e | Azienda | Numero di catalogo | |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| Cellule COS-7 | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamicina | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| PBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamina | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzima soluzione senza dissociazione cellulare | Invitrogen | 13151-014 | |
| Coniglio anti-TET repressore anticorpo policlonale | Millipore | AB3541 | |
| FITC-coniugato asino anti-IgG di topo (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Microscopio a scansione laser confocale | Olimpo | FV1000 | |
| FACSCalibur citofluorimetro | BD Biosciences | ||
| β-galattosidasi Assay sistema enzimatico con il tampone di lisi Reporter | Promega | E2000 | |
| Modello 100-40 UV-VIS | Hitachi | C740843 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
