Articolo metodologico

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L'utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

DOI:

10.3791/4378

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19 ottobre 2012

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.

Abstract

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Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine ​​sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine ​​SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi "girato" SNARE unità proteine ​​fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente.

Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall'espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l'attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L'attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm.

Le vescicole associate proteine ​​di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l'analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.

Protocollo

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1. Cultura e transfezione cellulare

  1. COS-7 cellule vengono coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 4,5 g / l di glucosio e 10% di siero bovino fetale (FBS).
  2. Trasfezione plasmide è fatto con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen).

2. Analisi al microscopio di fluorescenza Expression SNARE della superficie cellulare

  1. Il giorno prima della transfezione, 3 × 10 4 cellule COS-7 sono seminate su sterili 12-millimetri vetrini (Fisher Scientific) contenuti in piastre da 24 pozzetti.
  2. Per v-celle in ciascun pozzetto, 0,25 microgrammi....

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Risultati

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Per sviluppare un saggio quantitativo fusione cellulare, approfittiamo del forte attivazione trascrizionale dal legame di tTA a TRE. In assenza di tTA, trascrizione del gene LacZ in TRE-LacZ è silenzioso. Quando tTA è presente, si lega al TRE e attiva la trascrizione di LacZ. Figura 1 mostra un diagramma di flusso del saggio enzimatico fusione cellulare. tTA viene transfettato in v cellule che esprimono v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare, e TRE-LacZ viene t.......

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Discussione

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Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espres.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l'Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente e Azienda Numero di catalogo
DMEM Invitrogen 12800-017
Cellule COS-7 ATCC CRL-1651
tunicamicina Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
PBI-G Clontech 6150-1
lipofectamina Invitrogen 18324-012
Enzima soluzione senza dissociazione cellulare Invitrogen 13151-014
Coniglio anti-TET repressore anticorpo policlonale Millipore AB3541
FITC-coniugato asino anti-IgG di topo (H + L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Microscopio a scansione laser confocale Olimpo FV1000
FACSCalibur citofluorimetro BD Biosciences
β-galattosidasi Assay sistema enzimatico con il tampone di lisi Reporter Promega E2000
Modello 100-40 UV-VIS Hitachi C740843

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S.

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Tag

Quantificazione della beta galattosidasisistema di espressione genica Tet Offproteine VAMPproteine sintassinacellule COS 7citometria a flussoanalisi spettrofotometricaespressione di superficie cellulare

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