使用酶促细胞融合检测法分析SNARE介导的膜融合

摘要

我们开发了一种细胞融合检测方法，通过β-半乳糖苷酶的激活表达来定量SNARE介导的膜融合事件。

摘要

囊泡上的SNARE（soluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子attachment蛋白receptor）蛋白（v-SNARE）与靶膜上的SNARE蛋白（t-SNARE）之间的相互作用可催化细胞内囊泡融合^1-4。重建实验对于解析SNARE介导的膜融合机制及其调控至关重要⁵。在细胞融合实验^6,7中，SNARE蛋白在细胞表面异位表达。这些“翻转”的SNARE蛋白可驱动细胞间融合，证明SNARE足以介导细胞膜融合。由于细胞融合实验依赖显微镜分析，因此在定量分析多个v-SNARE和t-SNARE相互作用时效率较低。

本文介绍一种新的检测方法⁸，该方法通过激活β-半乳糖苷酶的表达来定量SNARE介导的细胞融合事件。该检测利用Tet-Off基因表达系统⁹的两个组分作为报告系统：四环素控制的转录激活因子（tTA）和一个在四环素反应元件控制下编码LacZ基因的报告质粒（TRE-LacZ）。我们将tTA转染至在细胞表面表达外翻v-SNARE蛋白的COS-7细胞（v细胞），并将TRE-LacZ转染至在细胞表面表达外翻t-SNARE蛋白的COS-7细胞（t细胞）。v细胞与t细胞之间依赖SNARE的融合导致tTA与TRE结合，从而启动LacZ的转录并表达β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶的活性通过分光光度法在420 nm处测定吸光度进行定量。

囊泡相关膜蛋白（VAMPs）是存在于多种高尔基体后囊泡区室中的v-SNAREs^10-15。通过在相同表达水平下表达VAMP1、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7和VAMP8，我们利用酶法细胞融合实验比较它们的膜融合活性。该实验基于光谱测量，为分析SNARE介导的膜融合以及高通量研究提供了一种定量方法。

方案

1. 细胞培养与转染

1. COS-7 细胞在添加了 4.5 g/l 葡萄糖和 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。
2. 质粒转染使用 Lipofectamine 按照制造商说明（Invitrogen）进行。

2. 细胞表面SNARE表达的荧光显微镜分析

1. 转染前一天，将 3×10⁴ 个 COS-7 细胞接种于 24 孔板中的无菌 12 mm 玻璃盖玻片（Fisher Scientific）上。
2. 对于每孔中的 v-细胞，将编码 tTA 的质粒（pTet-Off，CLONTECH）0.25 μg 与表达翻转 VAMPs 的质粒各 0.25 μg 共同转染。
3. 对于每孔中的 t-细胞，将编码 TRE-LacZ 的质粒（pBI-G，CLONTECH）0.25 μg 与表达翻转 SNAP-25 及 syntaxin 1 或 4 的质粒各 0.25 μg 共同转染。
4. 转染后 24 小时，用含 0.1 g/l CaCl₂ 和 0.1 g/l MgCl₂ 的 PBS++ 缓冲液配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，随后在含 10% FBS 的 PBS++ 中封闭 30 分钟。
5. 细胞与抗-Myc 单克隆抗体 9E10（未稀释的杂交瘤培养上清）在室温孵育 1.5 小时。
6. 用 PBS++ 洗涤四次后，细胞与 FITC 标记的二抗（Jackson Immunoresearch Laboratories）按 1:500 稀释度孵育 1 小时。
7. 再用 PBS++ 洗涤四次后，将标记的细胞用 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen）封片。
8. 在 Olympus 激光扫描共聚焦显微镜上采集共聚焦图像，并使用 Adobe Photoshop 软件处理图像。

3. 细胞表面SNARE表达的流式细胞分析

1. 转染前一天，将 2×10⁵ 个 COS-7 细胞接种至 6 孔板的每个孔中。
2. 转染翻转 SNARE、pTet-Off 和 pBI-G 质粒 24 小时后，用含 1% 多聚甲醛的 PBS++ 固定细胞 15 分钟，随后在含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS++ 中封闭 15 分钟。
3. 细胞与抗 Myc 单克隆抗体 9E10 在室温下孵育 60 分钟。
4. 用 PBS++ 洗涤三次后，细胞与 FITC 标记的二抗（1:200 稀释）在室温下避光孵育 45 分钟。
5. 再次用 PBS++ 洗涤三次后，使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。
6. 使用 BD Biosciences 的 FACSCalibur 流式细胞仪分析 15,000 个细胞，通过 CellQuest Pro 软件获取各样本的平均荧光强度。

4. 酶法细胞融合实验

1. 转染前一天，将 1.2×10⁶ 个 COS-7 细胞接种至每个 100-mm 组织培养皿中，将 2×10⁵ 个 COS-7 细胞接种至 6 孔板的每孔中。
2. 对于 v-细胞，将 0.5 - 5 μg 的翻转型 VAMP 质粒与 5 μg 的 pTet-Off 共同转染至每个 100-mm 培养皿中的细胞中。对照细胞则共转染空载体 pcDNA3.1(+) 和 pTet-Off。为防止 VAMP 1、4、5、7 和 8 的 N-糖基化，在转染期间于细胞培养基中加入衣霉素（10 μg/ml）。
3. 对于 6 孔板每孔中的 t-细胞，将 1 μg 的翻转型 SNAP-25 质粒和 pBI-G 与 0.5 μg 的翻转型 syntaxin1 质粒或 0.05 μg 的翻转型 syntaxin4 质粒共转染。
4. 转染后 24 小时，使用无酶细胞解离缓冲液（Invitrogen）将 v-细胞从培养皿中解离下来。用血细胞计数板计数后，将细胞重悬于含 10% FBS、6.7 μg/ml 衣霉素和 0.67 mM DTT 的 HEPES 缓冲 DMEM 培养基中。
5. 将 4.8×10⁵ 个重悬的 v-细胞加入已含有 t-细胞的每孔中。
6. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 6、12 或 24 小时后，按照生产商说明书（Promega）使用含报告裂解缓冲液的 β-半乳糖苷酶酶检测试剂盒检测 β-半乳糖苷酶的表达。简言之，细胞用 PBS 洗涤两次，然后用报告裂解缓冲液裂解。细胞裂解液与等体积的检测 2× 缓冲液混合。以报告裂解缓冲液与检测 2× 缓冲液混合液作为空白对照。
7. 90 分钟后，加入 1 M 碳酸钠终止比色反应。
8. 使用 HITACHI 100-40 分光光度计在 420 nm 处测定吸光度。

结果

为了建立定量的细胞融合检测方法，我们利用了tTA与TRE结合后产生的强效转录激活作用。在缺乏tTA时，TRE-LacZ中的LacZ基因转录处于沉默状态；当存在tTA时，它会结合到TRE上并激活LacZ基因的转录。图1展示了该酶法细胞融合检测的流程图。将tTA转染至表达v-SNARE蛋白的v细胞表面，将TRE-LacZ转染至表达t-SNARE蛋白的t细胞表面。v细胞与t细胞发生融合后，tTA即可结合TRE，从而启动LacZ的转录激活，并表达β-半乳糖苷酶。

图2A 展示了翻转SNARE构建体的结构域。催乳素前体信号序列与SNARE的N端融合。这些经改造的SNARE被称为“翻转SNARE”，因为其SNARE基序相对于细胞膜的方向发生了翻转。当用翻转SNARE质粒转染COS-7细胞时，翻转SNARE蛋白在细胞表面表达图2B）。流式细胞术用于检测SNARE蛋白在细胞表面的表达水平（图2...

讨论

最初的细胞融合实验⁶通过荧光显微镜检测SNARE介导的细胞融合事件。本文中，我们描述了一种创新性实验方法，通过β-半乳糖苷酶的激活表达及分光光度测定来定量分析SNARE介导的细胞融合事件。利用该方法，我们通常可在单次实验中分析15至20种v-和t-SNARE组合。通过流式细胞术检测细胞表面SNARE的表达水平，我们对VAMP蛋白的表达量进行滴定，并比较其膜融合能力（图2和图4）。此外，利用酶学细胞融合实验，我们确定了细胞融合活性对细胞表面VAMP1蛋白密度的依赖性，并观察到VAMP1蛋白在细胞融合反应中无协同效应⁸，表明多个SNARE复合物无需协同作用即可完成细胞膜融合。

SNARE 蛋白中存在推测的 N-糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）。由于 N-糖基化会抑制翻转 SNARE 蛋白的融合活性⁶，已有两种方法被用于防止翻转 SNARE 蛋白的糖基化。第一种方法是在翻转 SNARE 构建体中引入糖基化位点突变⁶；第二种方法如本实验方案所述，在细胞融合反应中加入 N-糖基化抑制剂衣霉素（6....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	12800-017
COS-7 细胞	ATCC	CRL-1651
衣霉素	Sigma-Aldrich	T7765-5MG
pTet-Off	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
脂质体转染试剂	Invitrogen	18324-012
无酶细胞解离液	Invitrogen	13151-014
兔抗 TET 抑制蛋白多克隆抗体	Millipore	AB3541
异硫氰酸荧光素标记的驴抗小鼠 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-095-150
激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
FACSCalibur 流式细胞仪	BD Biosciences
β-半乳糖苷酶酶学检测系统（含报告基因裂解缓冲液）	Promega	E2000
Model 100-40 紫外-可见分光光度计	Hitachi	C740843