Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

Resumo

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Resumo

As interacções dos SNARE (s factor de N-etilmaleimida sensível oluble ttachment um re ceptor de proteína) de proteínas em vesículas (v-SNAREs) e sobre as membranas-alvo (t-SNAREs) catalisam fusão das vesículas intracelulares ^1-4. Os ensaios de reconstituição são essenciais para dissecar o mecanismo e regulação de SNARE mediada por fusão de membrana ^5. Num ensaio de células de fusão ^6,7, proteínas SNARE são expressos ectopicamente na superfície da célula. Estes "invertida" SNARE proteínas unidade de fusão célula-célula, demonstrando que SNAREs são suficientes para fundir as membranas celulares. Uma vez que o ensaio de fusão de células é baseada na análise microscópica, é menos eficaz quando utilizado para a análise múltipla v-e t-SNARE interacções quantitativamente.

Descrevemos aqui um novo ensaio que quantifica ⁸ SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase. Doiscomponentes do sistema de expressão do gene Tet-Off ⁹ são utilizados como um sistema de leitura: o transactivador tetraciclina controlada (tTA) e um plasmídeo repórter que codifica para o gene LacZ sob o controlo do elemento de resposta a tetraciclina (TRE-LacZ). Nós tTA em transfectar células COS-7 que expressam invertidas v-SNARE proteínas na superfície da célula (V-células) e transfectam TRE-LacZ em células COS-7 que expressam invertida t-SNARE proteínas na superfície celular (células T) . SNARE dependente da fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição do LacZ e da expressão de β-galactosidase. A actividade de β-galactosidase é quantificado utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm.

As proteínas de vesículas associadas a membranas (Vamps) são v-SNAREs que residem em várias pós-Golgi compartimentos vesiculares ^10-15. Ao expressar Vamps 1, 3, 4, 5, 7 e 8 no mesmo nível, compara-se a sua fusão de membranaactividades utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. Com base em medições de espectrometria, este ensaio proporciona uma abordagem para a análise quantitativa SNARE mediada por fusão de membrana e de alto rendimento estudos.

Protocolo

1. Cultura de Células e Transfecção

1. Células COS-7 foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), suplementado com 4,5 g / l de glucose e 10% de soro fetal bovino (FBS).
2. Transfecção de plasmídeo foi feito com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

2. Análise microscópica de fluorescência de células de expressão de superfície SNARE

1. Um dia antes da transfecção, 3 × 10 ⁴ células COS-7 foram semeadas em lamelas estéreis de 12 milímetros de vidro (Fisher Scientific), contidos em placas de 24 poços.
2. Para v-células em cada cavidade, 0,25 ug....

Resultados

Para desenvolver um ensaio de fusão celular quantitativo, tiramos vantagem da activação transcricional forte pela ligação de tTA a TRE. Na ausência de tTA, a transcrição do gene LacZ em TRE-LacZ é silenciosa. Quando tTA estiver presente, liga-se ao TRE e activa a transcrição de LacZ. Figura 1 mostra um fluxograma do ensaio enzimático das células de fusão. tTA é transfectado em células que v-v-SNARE expressa proteínas na superfície celular, e TRE-LacZ é transfectado em.......

Discussão

O ensaio de fusão de células original, ⁶ determina SNARE mediadas por eventos de fusão de células por microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui um ensaio que quantifica inovador SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase e medição espectrométrica. Utilizando este ensaio, que rotineiramente analisar 15-20 v-e t-SNARE combinações em uma única experiência. Utilizando citometria de fluxo para medir a expressão SNARE na superfície da célula, é titular os níveis de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente e equipamento	Companhia	Número de catálogo
DMEM	Invitrogen	12800-017
Células COS-7	ATCC	CRL-1651
tunicamicina	Sigma-Aldrich	T7765-5mg
BRST-Off	Clontech	K1620-A
pBI-G	Clontech	6150-1
lipofectamina	Invitrogen	18324-012
Enzima livre de célula de solução de dissociação	Invitrogen	13151-014
Coelho anti-TET anticorpo policlonal Repressor	Millipore	AB3541
FITC-conjugado de burro anti-IgG de ratinho (H + L)	JacImmunoResearch KSON	715-095-150
Microscópio de varredura a laser confocal	Olimpo	FV1000
FACSCalibur citômetro de fluxo	BD Biosciences
β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzima com Tampão de Lise Repórter	Promega	E2000
Modelo 100-40 espectrofotómetro de UV-VIS	Hitachi	C740843