L&#39;uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all&#39;interno dei singoli tumori a cellule renali

Fiach C. O'Mahony; Jyoti Nanda; Alexander Laird; Peter Mullen; Helen Caldwell; Ian M. Overton; Lel Eory; Marie O'Donnell; Dana Faratian; Thomas Powles; David J. Harrison; Grant D. Stewart

doi:10.3791/50221

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

L'uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine all'interno dei singoli tumori a cellule renali

33.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50221

⸱

22 gennaio 2013

Fiach C. O'Mahony¹ , Jyoti Nanda¹ , Alexander Laird¹ , Peter Mullen² , Helen Caldwell³ , Ian M. Overton⁴ , Lel Eory⁴ , Marie O'Donnell¹^,⁵ , Dana Faratian⁶ , Thomas Powles⁷ , David J. Harrison¹^,² , Grant D. Stewart¹

¹Edinburgh Urological Cancer Group, University of Edinburgh, ²School of Medicine, University of St Andrews, ³Division of Pathology, University of Edinburgh, ⁴MRC Human Genetics Unit, MRC IGMM, University of Edinburgh, ⁵Department of Pathology, Western General Hospital, ⁶Breakthrough Breast Cancer Research Unit, University of Edinburgh, ⁷St Bartholomew's Cancer Institute, Experimental Cancer Medicine Centre, Queen Mary University of London

In questo articolo

Sommario

RPPA consente l'espressione della proteina di centinaia di campioni, stampati su vetrini nitrocellulosa da interrogare simultaneamente, utilizzando fluorescente anticorpi. Questa tecnica è stata applicata per studiare l'effetto di eterogeneità farmaco nel trattamento carcinoma a cellule renali chiare.

Abstract

Attualmente non esiste alcun trattamento curativo per carcinoma a cellule chiare metastatico a cellule renali, il più comune variante della malattia. Un fattore chiave in questa resistenza trattamento è pensato per essere la complessità molecolare della malattia ^1. La terapia mirata come l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), sunitinib sono stati utilizzati, ma solo il 40% dei pazienti risponde, con la stragrande maggioranza di questi pazienti recidivanti entro 1 anno ^2. Come tale la questione della resistenza intrinseca e acquisita nei pazienti con carcinoma renale delle cellule è molto importante ^3.

Al fine di studiare la resistenza a TKIs, con l'obiettivo finale di sviluppare efficaci, trattamenti personalizzati, tessuti sequenziale dopo un determinato periodo di terapia mirata è necessario, un approccio che ha avuto successo in ^quattro mieloide cronica leucemia. Tuttavia l'applicazione di tale strategia nel carcinoma renale è complicata dal livello di bOTH eterogeneità inter-e intratumorale, che è una caratteristica del carcinoma renale ^5,6 e altri tumori solidi ^7. Eterogeneità Intertumoral a causa delle differenze trascrittomica e genetico è ben definito anche nei pazienti con presentazione simile, stadio e grado del tumore. Inoltre, è chiaro che vi è grande morfologica (intratumorale) eterogeneità in RCC, che rischia di rappresentare ancora maggiore eterogeneità molecolare. Mappatura dettagliata e classificazione dei tumori RCC di combinata analisi morfologica e classificazione Fuhrman consente la selezione di aree rappresentative per l'analisi proteomica.

Analisi a base di proteine del RCC ⁸ è interessante per la sua ampia disponibilità in laboratori di patologia, ma la sua applicazione può essere problematico a causa della limitata disponibilità di anticorpi specifici ^9. A causa della natura dot blot delle matrici Reverse proteina di fase (RPPA), specificità anticorpale deve be pre-validato, in quanto tale controllo di qualità rigoroso di anticorpi utilizzati è di fondamentale importanza. Nonostante questa limitazione, il formato dot blot non consentono miniaturizzazione dosaggio, consentendo la stampa di centinaia di campioni su un vetrino nitrocellulosa singola. Diapositive stampate possono poi essere analizzate in modo simile ad analisi Western con l'uso di anticorpi specifici obiettivi primari e contrassegnati in modo fluorescente anticorpi secondari, consentendo multiplexing. Proteina espressione differenziale in tutti i campioni di una diapositiva possono essere analizzati simultaneamente confrontando il livello relativo di fluorescenza in un modo più conveniente e ad alta produttività.