Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l'infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all'infezione.
Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l'C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell'ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l'analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.
Introduzione
Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). La ma....
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Protocollo
1. Preparazione di Citrobacter rodentium inoculo e sonda gastrica di topi
- Preparare e sterilizzare in autoclave Luria Bertani brodo (LB).
- Ottenere vitale C. rodentium da uno stock di glicerolo congelata e striscia sulla piastra LB agar con un'ansa sterile da inoculo o punta della pipetta. Incubare a 37 ° C per una notte. Inoculare 3 ml di brodo LB sterile in una provetta di coltura falcon con colonie dalla piastra LB utilizzando una ansa o punta della pipetta. Preparazione dell'inoculo deve essere fatto utilizzando tecniche asettiche.
- Incubare la C. cultura rodentium aerobiosi a 37 ° C per una....
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Risultati
Durante un esperimento di infezione standard, i topi sono infettati con circa 2,5 x 10 8 UFC mediante sonda gastrica di 100 pl C. overnight rodentium cultura. Infezione di topi C57BL / 6 con C. rodentium risultati in perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Anche se un evento raro con C57BL / 6 topi, gli animali possono ammalarsi e richiedere euthanization. Pertanto, i topi devono essere monitorati per grado di perdita di peso e sintomi di disagio come pelliccia piloerect e .......
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Discussione
Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell'ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell'uso di questo modello.
Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l'analisi dell.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a BAV dal morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC) e degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR). GB è stato finanziato da una borsa di studio laureato CIHR. BAV sono i bambini con disturbi intestinali e del fegato (BAMBINO) presidente della Fondazione di Ricerca Pediatrica IBD e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Luria Broth | ABM | G247 | Aggiungere 25 g di polvere di LB 1L di acqua. Autoclave prima dell'uso. |
| Fondo piatto quadrato con griglia | Pescatore | 08-757-11A | |
| Falcon cultura tubo | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Lampadina punta dell'ago gastrica gavage | Strumenti Scienza Belle | 18060-20 | |
| 1 ml siringa | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-destrano | Sigma | FD-4 | |
| L'acido citrico | Sigma | C7129 | |
| Citrato di sodio | Pescatore | S279-500 | |
| Destrosio | Pescatore | D16.1 | |
| Acido citrato destrosio | 20 mM di acido ctiric, 110 mM di citrato di sodio, 5 mM destrosio | ||
| Nero piastra a 96 pozzetti | Pescatore | 07-200-762 | |
| Perle di metallo (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| Formalina 10% | Pescatore | 5F93-4 | |
| Flaconcino da 5 ml | DiaMed | STK3205 | |
| Ematossilina | Pescatore | H345-23 | |
| Eosina | Pescatore | E511-100 | |
| Xilene | Pescatore | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin colorazione jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodio citrato | Citrato di sodio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0 | ||
| Pap penna | Cedarlane | Mu22 | |
| Siero di capra | Sigma | G902-3 | |
| Albumina di siero bovino (BSA) | Pescatore | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodio azide | Sigma | SZ002 | |
| Tampone di arresto | Siero di capra 2%, 1% BSA, 0,1% triton X-100, Tween 20 0,05%, 0,05% di sodioazide, 0,01 M PBS, pH 7.2, mix & conservare a 4 ° C. | ||
| Anticorpo tampone di diluizione | 0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% di sodio azide, EDTA 0,04% | ||
| Tampone di arresto e anticorpi tampone di diluizione per tir | Ricette come sopra, ma senza aggiunta di detergenti (Triton X-100 e Tween 20) | ||
| Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI | Invitrogen | P-36.931 | |
| Coprioggetto | Pescatore | 12.54SE | |
| Agitatore da banco incubazione | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorimetro | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Centrifuga refrigerata | Beckman Coulter | Microcentrifuga 22R | |
| Piroscafo | Black & Decker | ||
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | Axio Image.Z1 |
Riferimenti
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel D....
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Ristampe e permessi
