Giant liposomfremstilling for billedbehandling og Patch-Clamp Elektrofysiologi

Summary

Færdigtilberedning funktionelle membranproteiner i kæmpeliposomer af definerede sammensætning er en kraftfuld metode, når det kombineres med patch-clamp elektrofysiologi. Dog kan konventionelle kæmpe liposomproduktion være uforeneligt med protein stabilitet. Vi beskriver protokoller til at lave kæmpeliposomer fra rene lipider eller små liposomer indeholdende ionkanaler.

Abstract

Genoprettelse af ionkanaler i kemisk definerede lipid membraner til elektrofysiologiske optagelse er blevet en kraftfuld teknik til at identificere og udforske funktionen af ​​disse vigtige proteiner. Men klassiske præparater, såsom plane dobbeltlag, begrænse manipulationer og eksperimenter, der kan udføres på den rekonstituerede kanal og dens membran miljø. Jo mere celle-lignende struktur af kæmpeliposomer tillader traditionelle patch-clamp eksperimenter uden at ofre kontrol af lipidet miljø.

Electroformation er en effektiv middel til at producere kæmpeliposomer> 10 um i diameter, som bygger på anvendelse af vekselspænding til en tynd, ordnet lipidfilm aflejret på en elektrode overflade. Men da den klassiske protokol kræver at lipiderne skal deponeres fra organiske opløsningsmidler, er det ikke kompatibelt med mindre robuste membranproteiner som ionkanaler og må modificeres. For nylig, PRotocols er blevet udviklet til electroform kæmpeliposomer fra delvis tørrede små liposomer, som vi har tilpasset til protein-holdige liposomer i vores laboratorium.

Vi præsenterer her baggrunden, udstyr, teknikker og faldgruber electroformation af kæmpeliposomer fra små liposomdispersioner. Vi begynder med den klassiske protokollen, som skal beherskes først, inden du forsøger de mere udfordrende protokoller, der følger. Vi illustrerer fremgangsmåden kontrolleret delvis dehydrering af små liposomer anvender damp ligevægt med mættede saltopløsninger. Endelig viser vi processen electroformation selv. Vi vil beskrive enkle, billige udstyr, der kan gøres in-house til at producere høj kvalitet liposomer, og beskrive visuel inspektion af præparatet på hvert trin for at sikre de bedste resultater.

Introduction

Kæmpeliposomer (ofte kaldet gigantiske unilamelvesikler eller GUVs) har primært været brugt til at studere fysik og fysisk kemi lipiddobbeltlagene, herunder undersøgelser af tolags deformation, lateral fase sameksistens ("flåder"), membranfusion mv ^1-4. De har en groft celle-lignende struktur: kugleskal membran omgiver en vandige indre, som let kan gøres anderledes end det omgivende vandige puffer. De er per definition ≈ 1-100 um i diameter, så de kan afbildes ved hjælp af en række lysmikroskopi tilgange. De kan gøres ud med den osmotiske gradienter eller mekanisk anvendes spænding, således at mens generelt bløde, kan deres egenskaber blive manipuleret for nem håndtering. Især styrer "stivhed" af liposomet gør det ligetil at danne "liposom-tilsluttede" eller udskåret patches til elektrofysiologi. I fortiden blev ionkanal rekonstituering hovedsageligt udført i plan lipid Bilayers. Nu, evnen til at danne patches fra kæmpeliposomer og bruge betydelige sitre af værktøjer udviklet til konventionel elektrofysiologi (fluorescens mikroskopi, mikropipette aspiration, hurtig perfusion og temperaturstyring, etc.) gør kæmpeliposomer mere attraktivt for rekonstitution undersøgelser ^5,6.

Kæmpeliposomer er blevet foretaget af mange strategier. Faktisk danner kæmpeliposomer spontant ved en hævelse proces, når en tørret lipidfilm rehydreres ^4,7,8. Ønsket om at hurtigere forberede større, mere ensartede liposomer fået forskerne til at andre tilgange, overstyrmænd blandt dem electroformation ^1,9. Electroformation ligeledes påberåbt sig hydrering af tørrede lipid film, men fremskynder processen ved anvendelse af et oscillerende elektrisk felt på tværs af lipid film. Feltet påføres gennem to elektroder, enten platin ledninger eller indium-Tin-oxid (ITO) belagt glas dias, adskilt af vand ellerbuffer og på hvilke lipider er deponeret. Ved at fremskynde hævelse af liposomer, opnår man et højere udbytte af større liposomer. Således har electroformation blevet standard metode til at producere kæmpeliposomer ^4..

Mekanismen af electroformation er ikke fuldt forstået, og de ​​fleste af de protokoller udviklet empirisk (f.eks ^10,11). Alligevel kan vi lære lidt om hvad de kan forvente ved at overveje teori og nogle empiriske resultater. Det er en udbredt opfattelse, at electroformation sker ved kørsel elektro-osmotisk strøm af buffer mellem de enkelte lipiddobbeltlag stablet i den deponerede lipidfilm ^10,11. Elektrostatisk kobling til termiske udsving i lipiddobbeltlagene er formentlig også involveret ^12.. Disse hypoteser kvalitativt forudsige øvre grænser for det elektriske felt frekvens og styrke, der kan anvendes ^10,12. I særdeleshed er det forudsagt, at høje ledeevne løsninger ( 12. Elektroosmotisk strømningshastigheder reduceres generelt med stigende saltkoncentration og ofte toppede på nogle elektrisk felt oscillationsfrekvens (f.eks omend i en anden geometri, Green et al. ^13). Således højere feltstyrker og højere frekvenser er rimelige for høj ledeevne løsninger inden for grænser ^10.

Men membranproteiner sandsynligvis vil være uforeneligt med den sædvanlige metode for at deponere lipider onto elektroder til electroswelling procedure, nemlig i organiske opløsningsmidler, som derefter afdampes til at forlade en tynd lipid film. Der er to primære stier omkring dette problem: at inkorporere proteiner efter gigantiske liposomdannelse eller tilpasse hvordan lipiderne er deponeret. Vores tilgang bygger på andres ^5,11 til at deponere lipider og reconstituted membran protein sammen fra en suspension af små eller store "proteoliposomer". Vi beskriver den langvarige og mere udfordrende proces at producere proteoliposomer fra oprenset protein og lipider andetsteds (Collins og Gordon, i gennemgang). Her beskriver vi protokollen i mangel af protein, men det er det samme, når protein er integreret; inkluderer vi resultater, der viser, at proteoliposomer indeholder ionkanal TRPV1 kan omdannes til GUVs og anvendes til patch-clamp elektrofysiologi. Under alle electroformation tilgang, er visuel inspektion af lipid prøven under lipidaflejring proces afgørende for succes.

Vores tilgang kan være relevant uden for specialiseret program til ion-kanal rekonstituering. I den tid, da vi først udviklet denne protokol, og nu er det også blevet vist, hvordan den måde, som lipider er deponeret på elektroder til electroformation påvirker kompositoriske heterogenitet af de resulterende GUVs. Baykal-Caglar et al. ^14. viste, at GUVs dannet ud fra omhyggeligt dehydrerede liposomer havde en 2,5 gange mindre variation i blandbarhed overgang temperatur GUVs dannet ud fra blandinger af forskellige phospholipider og kolesterol. Deres arbejde viser, at lipider og især kolesterol, kan bundfald lipidblandingen når aflejres fra organiske opløsningsmidler, hvilket resulterer i store rumlige variation i sammensætningen af ​​det deponerede lipid film. Dette er især vigtigt for studier af lipidmembranen fase adfærd, men kan også være kritisk for kvantitative eksperimenter på ionkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. 'S protokol er ens, men ikke identisk med vores egne, og læserne opfordres til at studere det så godt.

Denne protokol (se oversigt, figur 1) er en af mange, der kunne anvendes. I princippet electroformation succes afhænger af lipidblanding, hydrering, temperatur, andre opløste (især ioner), ognaturligvis spænding og frekvens, der anvendes i formationen. Som electroformation bliver bedre forstået, forventer vi at forfine vores protokol mere.

Endelig er der ofte en stejl indlæringskurve i galvanoformgivning kæmpeliposomer. Vi foreslår mastering den konventionelle protokol (afsnit 1 og 4, og om nødvendigt, afsnit 5), før at lære at deponere lipider fra liposomale suspensioner (afsnit 2-5).

Protocol

1.. Deposition af lipider fra organiske opløsningsmidler: Klassisk Protocol

1. Fjerne lipider fra opbevaring ved -20 ° C eller -80 ° C varm til RT Forsigtig:. Lipider er ekstremt hygroskopiske, og mange er følsomme for oxygen. Cover lipider i tør argon eller nitrogen gas og i alle trin minimere udsættelse for luft.
2. Hvis det er nødvendigt, suspendere lipider i chloroform eller cyclohexan på 1-10 mg / ml, bemærk at fabrikantens anførte koncentrationer er typisk nominelt kun ADVARSEL: Bær egnede handsker og andre personlige værnemidler, når du bruger organiske opløsningsmidler.. Fjern PPE hurtigt, hvis solvent er spildt på dem, da de fleste materialer er stadig gennemtrængelige for disse opløsningsmidler, og de ​​kun giver midlertidig beskyttelse.
3. Rengør begge sider af to 25 x 37,5 mm ITO belagt glas lysbilleder med ethanol
4. Bland lipider at opnå de ønskede molforhold. For hver 1 ^cm2 område ITO glider overtrækkes med læbeid, mix ~ 15-20 ug lipider. For eksempel, hvis begge 25 x 37.5 mm dias var at være fuldt belagt ville vi anvender typisk 30 pi 10 mg / ml lipidblanding Bemærk:. Tilføje 0,1 mol% Texas Red-DPPE til fluorescerende billeddannelse, og se nedenfor for anvisninger om fluorescerende farvestoffer.
5. Kontroller, at ITO-overtrukket side af objektglas vender opad ved at måle overfladen modstand med et ohmmeter eller multimeter.
6. Aspirer lipider i et opløsningsmiddel-resistent sprøjte Forsigtig:. Ingen lim eller plast, undtagen PTFE, bør kontakte det organiske opløsningsmiddel.
7. Med kanylen ikke helt rører ITO overflade, gælder langsomt lipidet flytte nålen frem og tilbage over objektglasset. Dække overfladen så jævnt, på udkig efter en "regnbue glans" på glasoverfladen.
8. Placer slides hurtigt under <1 Torr (1 mmHg) vacuum for 0,5-1 hr at fjerne ethvert spor opløsningsmiddel. Slip vakuum med inaktiv gas.
9. Anvende en silikone pakning, med entyndt lag silikone vakuum fedt på begge sider. Efterlad mindst 5 mm af udækkede slide eksponeret i den ene ende af dias.
10. Fortsæt straks til § 4.

2.. Lille liposomfremstilling for Controlled Dehydrering

1. Forbered lipidblandingen som i trin 1.1 til 1.4.
2. Tørre lipiderne ved hjælp af en strøm af argon eller nitrogen gas i en 10-15 mm kultur rør. For små mængder af lipider, ≤ 0,5 mg kan den resulterende film være hydreret direkte efter at placere den under vakuum i 0,5-1 hr at fjerne resterende opløsningsmiddel; gå til trin 2.5. Større mængder af lipid tendens til at fange organiske opløsningsmidler i en tyk gel, selv under vakuum, og er bedre forberedt ved lyofilisering, se trin 2,3-4.
3. Hæng den tørrede lipid film i cyclohexan, dække med Argon og tætning med en prop, skal du placere røret i en kold blok og fryse ved -80 ° C i 1 time minimum.
4. Placer kolde blok og lipid prøve i et vakuum-systemstand til at nå 100 mTorr. Påfør vakuum, det vil "stall" på omkring 1 Torr som opløsningsmiddel sublimerer off. Når opløsningsmidlet fjernes fuldstændigt (~ 1 time) vacuum vil falde til under dette niveau. Slip vakuum med inaktiv gas og forsegle røret eller hydrat straks.
5. Mens lipider er under vakuum, afgasses hydrering puffer anvendelse af vakuum og gennembobling ^15-17.
6. Hydrat lipiderne med afgasset buffer ved endelig koncentration 1-10 mg / ml. Lad lipider hydrat langsomt. Efter 30 min-1 time, vortex at bryde op resterende klumper. Vent en yderligere 0,5-1 timer for at tillade fuldstændig hydratisering. Brug et osmoticant, såsom sorbitol eller sucrose op til 200 mM, for at forhindre fuldstændig dehydrering i nedenstående trin.
7. Forbered 100-200 nm diameter liposomer ved ekstrudering. Se producentens ekstrudering protokol for detaljer. Bemærk, at bufferen skal have mindre end ~ 25 mM ionstyrke, eller specielle electroformation spænding protokoller vil være behov i afsnit 4..

3..Aflejring af lipider ved Kontrolleret Dehydrering af små liposomer

1. Forsigtig: Vores protokollen kræver lipider skal placeres i damp ligevægt med mættede saltopløsninger i mange timer. Vi anbefaler kraftigt at udføre protokollen i en inaktiv gas atmosfære ved hjælp af en handskerum eller lignende kabinet.
2. Forsigtig: Hvis der forbereder prøver indeholdende proteiner, undgå fuldstændig dehydrering. Hydrate atmosfæren i ethvert kabinet med et bæger med varmt vand eller en sonikator baseret luftfugter. Brug et hygrometer at sikre, at der er mindst 30% relativ fugtighed. Brug sorbitol eller sucrose i den lille liposom buffer som en ekstra sikkerhedsforanstaltning for at forhindre total dehydrering.
3. Forbered en mættet saltopløsning af passende relativ fugtighed. Target fugtighed afhænger osmolaritet Vehikelpræparationen. For præparater med fysiologisk osmolaritet, brug 30-45% relativ luftfugtighed, mens lav osmolaritet vesikel præparater kan være tilstrækkeligt dehydreret iligevægt med 75-90% RH (se også tabel 1).
4. Sæt den mættede saltopløsning og overskydende salt i en tæt forseglbar beholder med en indvendig hylde. Kommercielle mad containere til yoghurt og granola arbejde meget godt. Udskift hylden efter påfyldning, og sørg for væske er 5-10 mm under hylden.
5. Ren ITO coatede objektglas som i afsnit 1. Brug multimeter til at afgøre, hvilken side er ledende, og mærke den ikke-ledende side med prøven navn.
6. Smør begge sider af silikone (USP Grade VI) pakning (r) med en eller flere huller.
7. Placer slides ledende side op på bænken, og anvende silikone pakning (r) til hver dias, hvor lipid vil blive anvendt, og sørg for at der er mindst 5 mm blotlagt slide i den ene ende til at forbinde til electroformation apparatet. Glat pakningen for at sikre en god tætning.
8. Fortynd Vehikelpræparationen i en lav-salt isosmotisk buffer til ~ 1-2 mg / ml. Vi finder, at højere concentrtioner producerer dårlige resultater.
9. Påfør lipid til diaset i 1-10 gl dråber. Mindre dråber generelt bedre resultater.
10. Anbring diaset på den indvendige hylde over den mættede saltopløsning og forsegle beholderen tæt. Efterlad ved stuetemperatur i 3 timer til O / N. Beholderen kan anbringes ved 4 ° C, men bemærk, at for nogle salte, RH afhænger stærkt af temperaturen, og den kolde vil øge ækvilibreringstid.
11. Den resulterende film kan have en svag regnbue glans til det, men under alle omstændigheder skal vises næsten udtørret. Stærkt osmotiske startende løsninger kan være umuligt at tørre helt til et lipid film, og dette vil ikke påvirke resultaterne.

4.. Electroformation af kæmpeliposomer

1. Lipidfilm, især dem dannet af dehydrerede liposomer, er nemt forrykke. Forsigtigt hydrat hver brønd ved at placere en 27 G kanyle på kanten af pakningen og langsomt anvende buffer. Buffere kanomfatter vand, ≤ 200 mM saccharose, ≤ 1 M sorbitol og ≤ 5 mM HEPES. Mere end 10 mm saltopløsning kan kræve alternative electroformation spænding protokoller. Overfyldningsbeskyttelse hver pakning godt med ~ 10%.
2. Bemærk: når lipider er hydreret, hurtigt videre gennem de resterende trin, da lipid film begynder at delaminere det samme. Udbytte og størrelse maksimeres, hvis electroformation begynder straks.
3. I en glidende bevægelse, anvende en anden ITO slide, ledende ansigt i, til toppen af ​​pakningen. Sørg for at have mindst 5 mm udhæng udenfor pakningen området og modsat den første udhæng. Tryk forsigtigt for at sikre en god tætning.
4. Rengør de to udhæng hjælp ethanol og kontrollere, at siderne står pakningen er ledende med dit multimeter.
5. Kammeret kan yderligere sikres med parafilm eller lys fjederklemmer klip, hvis det ønskes.
6. Slut electroformation kammer til en spændingskilde ved at sikre aluminium eller kobber barer "EMI Gasket skum ", eller ledende-tape til de ledende overflader af de to dias. Vi bruger EMI skum. Planerne for en jig og klemme er vist i fig. 5.
7. Kontroller, at der ikke er nogen elektrisk kortslutning mellem kontakterne, og at de kontakter forbinde ordentligt til ITO overflader ved hjælp af multimeter.
8. Varm kammeret 10 ° C over den højeste smeltetemperatur nogen af lipiderne stede, f.eks DPPC, opvarmes til 52 ° C minimum, 10 ° C over kæden smeltetemperatur på 42 ° C.
9. For lav-salt buffere, anvendelse af en 10 Hz sinusbølge, ~ 0,7 V _rms for hver millimeter mellem de to ITO overtrukne overflader for 60-90 min. Ved høje saltpuffere, bør andre spænding protokoller anvendes (se referencer).

5.. Imaging og fejlfinding

1. Billede liposomet anvendelse af en inverteret mikroskop udstyret med et filter terning for rhodamin eller Texas Red-farvestoffer. Liposomet bør være sfæriskovervejende unilamellære med det blotte øje, og fri for defekter såsom "strenge" hængende fra liposomet.
2. Hvis liposomerne er for små, bruger mindre lipid.
3. Hvis der er mange fejl eller få liposomer, kan dette skyldes, at gel-fase lipider. Overvej at hæve electroformation temperatur.
4. Hvis nogle eller ingen kæmpeliposomer dannet på alle fra dehydreret små liposomer, reducere den osmotiske styrke af liposomet puffer, eller øge den osmotiske styrke electroformation buffer. En indkobling af puffer i den koncentrerede interstitielle pufferopløsning kan forårsage delaminering af deponerede lipidfilm.
5. Hvis vesikel udbytte, kvalitet eller størrelse er dårlig, og du indgår salte eller pH-buffere i electroformation eller liposom buffere, overveje alternative electroformation spænding protokoller. For eksempel, Pott, et al. ^11. anbefale en tretrins protokol ved at anvende en 500 Hz sinusbølge, hæve spændingen fra 50-1,300 Vpp / m løbet af 30 minutter, holdt i 90 min,n reducere frekvensen til 50 Hz i løbet af 30-60 min. Platin eller titanium elektroder kan være nødvendig i dette tilfælde, men dette vil ikke væsentligt ændrer protokollen.

Representative Results

I vores eksempel, forbereder vi liposomer fra en blanding af omkring 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphoserin , 30 mol% kolesterol, og 0,1 mol% Texas Red-mærket 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamin (TXR-DPPE). Denne sammensætning blev valgt som ca repræsentative for Dorsalrodsganglieceller lipider ^{18 år.} Vi konstaterer, at 15 mol% opladet lipid (her POP) er tæt på grænsen for, hvad der kan bruges i electroformation (f.eks Walde et al. ^4).

Lipid opdeling efter hydrolyse og peroxidation er et meget stort problem for mange lipid blandinger og mange følsomme eksperimenter (se diskussion). For klarhedens alene bruger vi ikke inaktive gasatmosfærer i videoen præsentation. Som det fremgår af nedenstående figurer, er dette ikke mærkbart påvirke kvaliteten af ​​liposomer, men for følsomme undersøgelser ellernår højt umættede lipider, er det vigtigt at forhindre lipid opdeling.

Da den store hurdle i electroformation er at danne en god lipid film på Indium-Tin Oxide (ITO) substrat, vel vidende, hvad lipid film skal se ud, når tørret er afgørende. Men når electroformation mislykkes, er det ofte gør så fuldstændig, hvilket resulterer i nogen mærkbar kæmpe liposomproduktion. Ofte vil betydelige efterladenskaber overholdes, hvilket typisk indikerer, at for meget lipid er blevet brugt. Vores tal viser, hvad man forventer at se på succes.

Figur 2 viser to forskellige pletter af liposomer elektroformede fra lipider deponeret ud chloroform. I panelet til venstre, nøje undersøge, patches angivet med pile. 2 og 3. Mens pilen 2 angiver en patch med dårligt skelnelige liposomer, kan der ikke liposomer bringes i fokus i det område, angivet ved pil 3. Sammen disse resultater tyder på en generelt dårligforberedelse, sandsynligvis på grund af at der er for meget lipid deponeret på dette område. I det højre panel, er sådanne "fuzzy" regioner mindre almindeligt, hvilket indikerer en generelt bedre forberedelse. Vi finder, at det er sjældent at helt at eliminere sådanne mangler.

Figur 3 viser liposomer held elektroformede fra lipider deponeret ved dehydrering af små liposomer, ved to forstørrelser, filmede med Texas Red epifluorescens. Liposomer er sparsomme, men der er flere gode prøver. Fordi størrelse varierer, flere er ude af fokus. Pilene angiver tre gode kvalitet liposomer varierer i størrelse fra ~ 5-20 um, hvoraf to vises i 40x forstørrelse billedet. Bemærk den klare "ring" på kanten: dette indikerer en unilamellar eller næsten unilamellart liposom. Mens nogle pletter af lipid tilsyneladende brudt sammen eller aldrig dannet lipid, det er en god kvalitet resultat.

Endelig vores formål at udvikle og udgive denne protokoler at forberede GUVs med intakte, funktionelle mammale ionkanaler, der er egnet til konventionel patch-clamp elektrofysiologi. I figur 4 vi vise capsaicin-aktiverede TRPV1 ionstrømme optaget i lipidmembran patches udskåret fra GUVs dannet ved hjælp af denne protokol. Strømmen kan blokeres af Ruthenium Red, og ikke aktiveres af capsaicin køretøj (0,1% ethanol, 138 mM NaCI, 3 mM HEPES pH 7,4) alene. Udarbejdelsen af ​​proteoliposomer for elektrofysiologi eksperimenter er langt uden for rammerne af denne protokol, men er genstand for en indleveret artiklen.

Salt	Molality @ 20 ° C og mætning	% RH @ 10 ° C	% RH ved 20 ° C	% RH ved 30 ° C
Magnesiumchloridhexahydrat	5.8	33	33 32
KALIUMCARBONAT Dihydrat	8,0	47	44	42
Natriumbromid	4.6	58	57	57
Cuprichlorid	5.6	68	68	67
Sodium Chloride	6.13	75	75	75
Kaliumchlorid	4,61	87	86	84

Tabel 1. Relativ fugtighed (% RH) af flere almindelige salte relative fugtighed data fra Greenspan ¹⁹ og Rockland ^20,. Mætning data fra de internationale Kritiske Tables ^21.

Figur 1. Skematisk af gigantiske liposom electroformation fra små liposomer. (Øverst til venstre) Små liposomer er deponeret i en vifte af små dråber, <5 pi. (Øverst i midten) Liposomerne er dehydreret under kontrolleret relativ fugtighed ved at placere dem i en forseglet beholder over en mættet saltopløsning. Et hygrometer er valgfrit. (Øverst til højre) Når dehydreret til en klæbrig film af lipid og (muligvis) osmoticant såsom sorbitol, er lipider rehydreres i et hyperosmotisk buffer (se protokol afsnit 5). (Nederst til venstre) i electroformation kammeret er forseglet med en anden ITO slide på toppen. (Nederst til højre) Endelig er kammeret opvarmes til over lipidkæde smeltetemperatur, og forbundet til en signalkilde giver et oscillerende elektrisk felt på tværs af de to ITO dias.

Figur 3. Elektroformet kæmpeliposomer dannet af dehydrering-deponerede lipider. (Venstre) Ved 10x forstørrelse, flere liposomer er synlige. Tre liposomer mærkes. (Til højre) Den samme opfattelse som til venstre på 40x forstørrelse, med sammeliposomer (2 og 3) mærkes. Antallet af disse liposomer er typisk meget mindre, end når electroforming fra opløsningsmiddel-deponeret lipid, men er helt tilstrækkelig til mange formål. Filmede med et inverteret epifluorescensmikroskop udstyret med en Chroma 41004 Texas Red filter terning og Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensiveret CCD kamera.

Figur 4.. Capsaicin aktiveret TRPV1 strøm registreret i en membran patch udskåret fra en GUV dannet ved hjælp af denne protokol. A. Lækstrømmen indikerede en 500 MOhm forsegle modstand før capsaicin tilsat. B. Saturating capsaicin (> 20 uM, i 0,1% ethanol) aktiverer en store TRPV1 nuværende,. den nuværende er blokeret af Ruthenium Red, og er ikke aktiveret af køretøj (0,1% ethanol i buffer) alene (data ikke vist) C. løbende afkasttil nær baseline som capsaicin udvaskes af plasteret.

Figur 5. Planer for electroformation kammer. Inkluderet er en oversigt, der viser den komplette samling, og dimensioneret skemaer for de øverste og nederste stykker af plast. Brug akryl eller andet let bearbejdet klar plast. Den tynde Kapton film varmelegeme skal tilsluttes temperatur regulatoren (se tabel af specifikke reagenser og udstyr), og EMI skum skal tilsluttes den funktion generator, således at sinusbølge påtrykkes på tværs af de to ITO coatede objektglas. Et hul er fastsat for en temperaturføler. Flathead 10-32 skruer er placeret i forsænkede huller i det nederste stykke, og passere gennem det øverste stykke. 10-32 møtrikker anvendes til at fastgøre samlingen. Når den er fuldt såsembled bør den øverste og nederste plastik stykker flugter med hinanden på to sider (siderne parallelt med EMI.) Klik her for at se større figur .

Discussion

Electroformation af kæmpeliposomer har udviklet sig til en fleksibel teknik kompatibel med diverse lipider, præparater og buffere. Omhyggelig kontrol af lipidaflejring processen er mest kritisk for succes. Vi har præsenteret enkle værktøjer til at gøre kontrolleret aflejring af lipider fra små liposompræparater en enkel proces. Den relative fugtighed er kritisk for korrekt dehydrering af de oprindelige liposomer, og den optimale værdi vil variere med den oprindelige koncentration af opløste stoffer i liposomsuspensionen. Lavere relativ luftfugtighed er forpligtet til at dehydrere mere koncentrerede prøver til et passende niveau.

Den nøjagtige hydrering protokol og elektrisk felt anvendes til electroformation stadig et diskussionspunkt ^{1,4,7,10,11,22.} Den enkleste protokoller skal beherskes først, inden du forsøger liposom electroformation i tilstedeværelse af høje saltkoncentrationer, ladede lipider, eller meget høje koncentrationer af høj smelteING temperatur lipider. Når disse færdigheder beherskes, mere avancerede protokoller typisk opdele electroformation processen i tre dele: indledende hævelse, vækst og løsrivelse. Indledende hævelse synes at være begunstiget ved langsomt at øge påtrykte elektriske felt ^11. En anden, valgfri trin på fast feltstyrke kan hjælpe med at kontrollere den endelige størrelse af liposomerne. Endelig kan reducere frekvensen af ​​det oscillerende felt hjælpe at frigøre liposomer fra ITO overflade. Højere frekvenser er nødvendige for at electroform liposomer i fysiologiske saltbetingelser ^11, men liposomer kan dannes over en meget bred vifte af marken frekvenser og amplituder ^10.

Den iagttagelse, at kæmpeliposomer vil danne spontant efter rehydrering af dehydrerede liposomer med en hypo-osmotisk buffer ⁷ angiver adskillige nøgler til succes. Først liposomet hævelse processen begynder straks, så der for electroformation, noglegrupper har endda fundet det nyttigt at anvende AC elektrisk felt, før rehydrerende lipidfilmen ^10.. For det andet er det sandsynligt, at fluidstrømning driver liposomale hævelse proces, og at electroformation forekommer i det mindste delvist på grund af elektro-osmotisk drevet flow. Dette sætter grænser for den anvendelige frekvens og amplitude interval, der kan bruges i electroformation ^10..

Et stort diskussionspunkt i de sidste mange år har været potentialet for lipid hydrolyse og peroxidation ^23,24. Den første forsvar mod lipid nedbrydning af enhver art er at fjerne oxygen fra alle materialer i GUV præparatet: da peroxidation afhænger molekylært oxygen ^23, bør forsinke processen betydeligt. En kombination af vakuum og gennemluftning med inaktiv gas bør bruges til at fjerne så meget oxygen som muligt ^15-17. Lydbehandling og let vakuum er ineffektive. Vi bruger ilt testkit (Chemetrics K7501) til verify at vi har fjernet ilt så grundigt som muligt. Hydrolyse er mere skadelige, men reduceres ved at opretholde neutral pH ^25, og ved at reducere den spænding, der anvendes i electroformation ^24.. Nogle forfattere taler for brugen af titanium elektroder i stedet for ITO glider ^23,24,26,27. Vi foretrækker at undgå muligheden for at forurene vores prøver med titanium (eller noget metal), idet det har tidligere været kendt for at blande sig liposom eksperimenter ^28,29, men det kan bidrage til at forhindre, at nogle peroxidation eller hydrolyse effekter. Det siger sig selv, at langvarig udsættelse for høje temperaturer accelererer lipid opdeling ^30. Endelig tyndtlagskromatografi ^24,31, kolorimetriske assays ^23, og andre metoder ³¹ findes at kvantificere lipid nedbrydning.

Et lignende spørgsmål vedrører de fluorescerende lipid farvestoffer, der anvendes til at afbilde GUVs, især for studier af lateral faseadskillelse ^30,32 30,33, og anvendes ved minimal koncentration.

Vi er ikke bekendt med nogen konsensus om hvorvidt ITO elektrode slides kan genbruges. Mange grupper gør genbruge deres ITO dias, mens nogle ikke gør. Nylige undersøgelser tyder desuden dias do nedbrydes med tiden, men kan anneales til genvinde højtydende ^34, denne nedbrydning havde kun en lille effekt for lipidblandinger herunder zwitterioniske eller anioniske lipider, men var kritisk for blandinger indeholdende kationiske lipider. Vi genbruger vores lysbilleder uden udglødning.

Selv om der er stor variation i de protokoller, der anvendes til at electroform kæmpeliposomer, den teoretiske forståelse og praktisk erfaring med teknikken er konstant forbedring. Allerede liposomer kan dannes med store mængder af ladede lipider, eller i høj saltpuffere. Nøglen er effektiv aflejring af lipider på elektrodeoverfladen, which er kernen i vores protokol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667