Summary
Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.
Abstract
Elektrofizyolojik kayıt için kimyasal yapısı lipid membranlar içine iyon kanallarının sulandırma bu önemli proteinlerin işlevini tanımlamak ve keşfetmek için güçlü bir teknik olmuştur. Ancak, düzlemsel bilayers gibi klasik preparatlar, sulandırılmış kanal ve membran ortamında yapılabilir manipülasyonlar ve deneyler sınırlar. Dev lipozomlar daha fazla hücre-benzeri bir yapı lipid ortam kontrolü ödün vermeden geleneksel patch-clamp deneyleri izin verir.
Electroformation bir elektrot yüzeyinde biriken ince, sipariş edilen lipit filme gerilim alternatif uygulama dayanır çapı dev lipozomlar> 10 um üretmek için etkili bir ortalamasıdır. Klasik protokol organik çözücüler yatırılır lipidler çağrısında beri Ancak, iyon kanalları gibi daha az güçlü membran proteinleri ile uyumlu değildir ve değiştirilmesi gerekir. Son zamanlarda, protocols bizim laboratuarda protein içeren lipozomlara adapte kısmen kurutulmuş küçük lipozomlar arasından dev lipozomlar Electroform için geliştirilmiştir.
Burada arka plan, ekipman, teknikleri, ve küçük lipozom dağılımları gelen dev lipozomlar electroformation tuzaklar mevcut. Biz takip daha zorlu protokolleri başlamadan önce ilk hakim olmalıdır klasik protokol ile başlar. Biz doymuş tuz çözeltileri ile buhar denge kullanarak küçük lipozomlar kontrollü kısmi dehidrasyon süreci göstermektedir. Son olarak, electroformation kendisinin işlemi göstermektedir. Biz yüksek kaliteli lipozomlar üretmek ve en iyi sonuçları elde etmek için her aşamada hazırlık görsel denetim tanımlamak için in-house yapılabilir basit ve ucuz ekipman anlatacağız.
Introduction
Dev lipozomlar (genellikle dev unilamellar veziküller veya GUVs denir) öncelikle çift katlı deformasyon, yanal faz bir arada ("sal"), membran füzyon, vb 1-4 çalışmaları da dahil olmak üzere çift katlı lipit katmanını fiziği ve fiziksel kimya, incelemek için kullanılmıştır. Kolayca çevredeki sulu tampon farklı yapılabilir, sulu bir iç çevreleyen zarın küresel kabuk: Bir ağır hücre-benzeri bir yapıya sahiptir. Onlar, tanımı gereği, çapı ≈ 1-100 mikron, böylece ışık mikroskobu çeşitli yaklaşımlar kullanılarak görüntülenebilir vardır. Bunlar genellikle yumuşak iken, bunların özellikleri kolay kullanım için manipüle edilebilir, böylece ozmotik eğimleri veya mekanik olarak uygulanan gerilim ile gergin yapılabilir. Özellikle, lipozomun bir "sertlik" elektrofizyoloji "lipozom-bağlı" ya da eksize yamalar oluşturmak için o basit kontrol etmektedir. Geçmişte, iyon kanalı sulandırma büyük ölçüde düzlemsel bir lipit b gerçekleştirildiilayers. Şimdi, dev lipozomlar gelen yamalar oluşturmak ve geleneksel elektrofizyoloji için geliştirilen araçların önemli titreme (floresan mikroskobu, mikropipet aspirasyon, hızlı perfüzyon ve sıcaklık kontrolü, vb) kullanma yeteneği sulandırma çalışmaları 5,6 için dev lipozomlar giderek daha cazip hale getirmektedir.
Dev lipozomlar birçok strateji tarafından yapılmıştır. Kurutulmuş bir lipid filmi 4,7,8 sulandırılır Aslında, dev lipozomlar bir şişme işlemi ile kendiliğinden oluşturur. Daha hızlı daha büyük hazırlamak arzusu, daha düzgün lipozomlar electroformation 1,9 aralarında baş diğer yaklaşımlar, araştırmacılar yol açtı. Electroformation de kurutulmuş bir lipid filmi hidrasyonu dayanır, ancak lipid filmi arasında salınımlı bir elektrik alanının uygulanması yoluyla işlemini hızlandırır. Alan veya su ile ayrılmış, iki elektrot, platin teller ya veya İndiyum-Kalay-Oksit (ITO) kaplı cam slaytlar ile uygulanırtampon ve hangi üzerine lipidler yatırılır. Lipozomlar şişme hızlandırarak, daha büyük bir lipozomlann daha yüksek bir verim elde eder. Böylece, electroformation dev lipozomlar 4 üretmek için varsayılan yöntem haline gelmiştir.
Electroformation mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve protokollerin çoğu (örneğin 10,11) deneysel olarak geliştirilmiştir. Yine de, teori ve bazı ampirik sonuçları dikkate alınarak beklemek ne hakkında biraz bilgi edinebilirsiniz. Bu yaygın electroformation biriken lipid filmi 10,11 yığılmış bağımsız lipid iki tabakanın arasında bulunan bir tampon arasında elektro-ozmotik akış sürerek olduğuna inanılır. Çift katlı lipit katmanını termal dalgalanmalara Elektrostatik bağlantısı da muhtemelen 12 ilgilenmektedir. Bu hipotez niteliksel 10,12 kullanılabilir elektrik alan frekans ve güç için üst sınır tahmin. Özellikle de, bu yüksek iletkenliği olan çözümler tahmin edilmektedir (
Bununla birlikte, membran proteinleri daha sonra, ince bir lipid filmi terk etmek için buharlaştırılarak organik çözücü içinde, yani, electroswelling işlem için elektrotlar üzerine lipid yatırma olağan yöntem ile uyumlu olması muhtemeldir. Bu zorluk etrafında iki temel yol vardır: dev lipozom oluşumundan sonra proteinler dahil etmek, ya da lipid yatırılır nasıl adapte. Yaklaşımımız lipid ve reconsti yatırmak diğerleri 5,11 üzerine inşaküçük veya büyük "proteoliposomes" bir süspansiyon araya membran proteini TÜTED. Biz (Collins ve Gordon, yorumda) başka bir yerde protein ve lipid saflaştırılmış proteoliposomes üretme uzun ve daha zorlu süreci tanımlamak. Burada, herhangi bir proteinin yokluğunda protokol açıklar, ancak protein dahil edildiğinde bu aynıdır, biz iyon kanalı TRPV1 içeren proteoliposomes GUVs dönüştürülmüş ve patch-clamp elektrofizyoloji için kullanılabilir olduğunu gösteren sonuçlar bulunmaktadır. Her electroformation yaklaşımda, lipit birikmesini işlemi sırasında lipid örnek görsel inceleme başarısı için çok önemlidir.
Yaklaşımımız iyon kanalı sulandırma için özel bir uygulama ilerisi için uygun olabilir. Öncelikle bu protokolü geliştirildi ve şimdi, aynı zamanda lipid electroformation için elektrotlar üzerinde biriken edildiği şekilde ortaya çıkan GUVs en kompozisyon heterojen nasıl etkilediğini gösterilmiştir beri süre içinde. BaykAl-Çağlar ve ark. 14 dikkatle kurutulmuş lipozom oluşan GUVs çeşitli fosfolipidleri ve kolesterol karışımlarından oluşan GUVs karışabilirliklerine geçiş sıcaklığında bir 2.5 kat daha küçük bir varyasyonu olmadığını gösterdi. Bunların çalışma lipid kanşımından lipidler, özellikle de kolesterol, Mayıs çökelti biriken lipid filmi bileşiminde büyük mekansal değişimi ile sonuçlanan, organik çözücü tevdi var olduğunu gösterir. Bu lipit membran faz davranışları çalışmaları için önemlidir, aynı zamanda iyon kanalı fonksiyonu kantitatif deneyler için kritik olabilir. Baykal-Çağlar ve ark. 'In protokol benzer ama kendi ile aynı değildir, ve okuyucular gibi iyi çalışmak için teşvik edilmektedir.
Bu protokol, (genel bakış, Şekil 1 'e bakınız) kullanılabilir birçok biridir. Prensip electroformation başarı olarak lipit karışımı, hidrasyon, sıcaklık, diğer solütler (özellikle iyonlar), ve bağlıdıroluşumunda kullanılan ders voltaj ve frekans. Electroformation daha iyi anlaşılır hale geldikçe, daha bizim protokol rafine bekliyoruz.
Son olarak, dev lipozomlar elektro dik bir öğrenme eğrisi çoğu zaman. Biz lipozomal süspansiyonlar (Bölüm 2-5) den lipidler yatırmak öğrenme önce mastering geleneksel protokolü (Bölüm 1 ve 4, ve, gerekirse, Bölüm 5) öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Organik Solventler gelen Lipidler birikimi: Klasik Protokolü
- . -20 ° C veya -80 ° C 'de depolama lipidler çıkarın; rt'ye Dikkat: Lipidlerin çok higroskopiktir ve çok sayıda oksijen duyarlıdır. Kuru Argon veya azot gaz lipidler Kapak ve tüm adımları hava maruz kalma en aza indirmek.
- Gerekirse, mg / ml 1-10 de kloroform veya sikloheksanda lipidler askıya; üreticinin belirtilen konsantrasyonları sadece DİKKAT genellikle anma olduğuna dikkat:. Organik çözücü kullanırken uygun eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman kullanın. Birçok malzeme hala bu çözücülere geçirgen ve sadece geçici koruma sağlamak gibi çözücü, onlara dökülen olmadığını hızlı bir şekilde KKD çıkarın.
- Etanol ile iki 25 x 37.5 mm ITO kaplı cam slaytlar her iki temizleyin
- Istenen molar oranları elde etmek için lipidler karıştırın. Her 1 cm için İTO alanı 2 dudak ile kaplı olması slaytlarid, karışım ~ lipidlerin 15-20 mg. . Hem 25 x 37.5 mm slayt tamamen kaplanacak olsaydı Örneğin, biz genellikle 10 mg / ml lipid karışımı Not 30 ul kullanabilirsiniz: Texas floresan görüntüleme için Kırmızı-DPPE ve için aşağıya bakınız hakkında uyardı 0.1 mol% ekleyin floresan boyalar.
- Cam slaytların İTO kaplı yan bir ohmmetre veya multimetre ile yüzey direnci ölçerek yukarı baktığından emin olun.
- . Bir çözücü dayanıklı şırınga Dikkat içine lipidler aspire: Hayır yapıştırıcılar veya PTFE dışında plastik, organik çözücü başvurmalısınız.
- Şırınga iğnesi oldukça İTO yüzeyine dokunmadan ile, yavaş yavaş slayt sağına soluna iğne hareket lipid geçerlidir. Cam yüzey üzerinde bir "gökkuşağı parlaklık" arayan, eşit olarak kaplanmalıdır.
- Herhangi bir iz çözücünün çıkması için 0.5-1 saat boyunca, <1 torr (1 mm Hg) vakum altında hızlı bir şekilde Saydamlarınızı. Inert gaz ile vakum bırakın.
- Bir ile, bir silikon conta uygulayınher iki tarafta silikon vakum yağ ince bir tabaka. Sürgünün bir ucunda açık ortaya bir slayt, en az 5 mm bırakın.
- Bölüm 4 hemen geçin.
2. Kontrollü Dehidrasyon için küçük Liposome Hazırlık
- Adım 1.1 'de 1.4 lipid karışım hazırlayın.
- 10-15 mm çaplı kültür tüpü bir Argon akımı ya da azot gazı kullanarak lipidler kurutun. Lipidler az miktarda için, ≤ 0.5 mg, ortaya çıkan film, doğrudan kalan solvent kaldırmak için 0.5-1 saat vakum altında yerleştirdikten sonra sulu olabilir; 2.5 adıma geçin. Lipid büyük miktarlarda bile, vakum altında yoğun bir jelin organik solvent tuzağına düşebilmektedirler ve daha iyi liyofilizasyon ile hazırlanır; adımları 2.3-4 bkz.
- , Sikloheksan içinde kuru lipid filmi Askıda bir tapa ile Argon ve contalı kapak, en az 1 saat boyunca -80 ° C 'de soğuk bir blok ve dondurucuda tüp yerleştirin.
- Bir vakum sisteminde soğuk blok ve lipid örnek yerleştirin100 mTorr ulaşma yeteneğine. Vakum uygulayın, bu çözücü sublimes kapalı olarak yaklaşık 1 mmHg 'de "durak" olacak. Bir kez çözücü tamamen (~ 1 saat) kaldırılır vakum bu seviyenin altına düşecek. Inert gaz ile vakum serbest bırakın ve hemen tüp veya hidrat mühür.
- Lipidler vakum altında iken, gazını hidrasyon tampon vakum kullanılarak ve 15-17 serpilerek.
- Nihai konsantrasyon yaklaşık 1-10 mg / ml 'de gazı alınmış tamponu kullanılarak lipidlerin hidratı. Yavaş yavaş hidrat için lipidler izin verin. Sonra 30 dakika-1 saat, kalan kümeleri kırmak için girdap. Tam hidrasyon için izin vermek için ek bir 0.5-1 saat bekleyin. Aşağıdaki adımda tam su kaybını önlemek için, bu tür 200 mm'ye kadar, sorbitol veya sukroz gibi, bir osmoticant kullanın.
- Ekstrüzyon ile 100-200 nm çapında lipozomlar hazırlayın. Ayrıntılar için üreticinin ekstrüzyon protokolü. Tampon ~ 25 mM iyonik kuvvet, ya da özel electroformation gerilim protokolleri daha az Bölüm 4 gerekli olacak olması gerektiğini unutmayın.
3.Küçük Lipozomlar Kontrollü Dehidrasyon tarafından Lipidlerin birikimi
- Dikkat: Bizim protokol lipidler birçok saat boyunca, doymuş tuz çözeltileri ile buhar denge içinde yerleştirilmesini gerektirir. Önemle bir torpido gözü veya benzeri muhafaza kullanarak, bir inert gaz atmosferinde protokol performans tavsiye ederiz.
- Dikkat: proteinleri içeren örnekleri hazırlamak ise, tam dehidratasyonu önlemek. Hidrat sıcak su kabı ile herhangi bir muhafaza içinde atmosfer, ya da bir sonikatör tabanlı nemlendirici. En az% 30 nispi nem olmadığından emin olmak için, bir higrometre kullanın. Toplam su kaybını önlemek için ek bir önlem olarak küçük bir lipozom tamponu içinde sorbitol veya sukroz kullanın.
- Uygun bir nisbi rutubet doymuş bir tuz çözeltisi hazırlayın. Hedef nem vezikül hazırlık ozmolarite bağlıdır. Düşük osmolaritesi vezikül hazırlıklarında yeterli susuz olabilir iken fizyolojik osmolaritesi ile hazırlıkları için, 30-45% RH kullanımı75-90% RH (Tablo 1 Ayrıca bakınız) ile denge.
- Bir iç raf bir sıkı yapışmalı kapta doymuş tuz solüsyonu ve aşırı tuz koyun. Çok iyi yoğurt ve granola iş için ticari gıda kapları. Doldurduktan sonra raf değiştirin ve emin sıvı raf altında 5-10 mm olduğundan emin olun.
- Bölüm 1'deki gibi temiz ITO kaplı slaytlar. Iletken olan tarafı belirlemek ve örnek adı ile iletken olmayan tarafı etiketlemek için multimetre kullanın.
- Hafifçe yağ bir veya daha fazla delik ile silikon (USP VI) conta (lar) arasında her iki taraf.
- Bankta slaytlar iletken tarafı yukarı yerleştirin ve electroformation aparatı bağlanmak için bir ucunda maruz slayt en az 5 mm olduğundan emin yapma, lipid uygulanacak her slayt için silikon conta (lar) uygulanacaktır. Iyi bir sızdırmazlık sağlamak için conta pürüzsüz.
- ~ 1-2 mg / ml için düşük tuz isosmotic tampon vezikül hazırlık sulandırmak. Biz daha yüksek concentr bulmakations kötü sonuçlar üretir.
- 1-10 ul damla slayt lipid uygulayın. Küçük damla genellikle daha iyi sonuçlar üretir.
- Doymuş tuz çözeltisi üzerinde iç rafta slayt yerleştirin ve sıkıca konteyner mühür. O / N ile 3 saat için oda sıcaklığında bırakın Kabın 4 ° C sıcaklıkta yerleştirilebilir, ancak bazı tuzları, RH sıcaklık ve bu soğuk sıkı sıkıya bağlıdır dikkat dengelenme süresi artar.
- Ortaya çıkan film, ona hafif bir gökkuşağı parlaklık olabilir, ama her durumda yaklaşık kurutulmuş görünmelidir. Yüksek ozmotik başlangıç çözümleri bir lipid filmi tamamen kurumasını imkansız olabilir, bu olumsuz sonuçları etkilemez.
4. Dev lipozomlar Electroformation
- Özellikle lipid filmi, kurutulmuş lipozom oluşan bu, kolayca yerinden edilir. Dikkatlice hidrat her bir contanın kenarında bir 27 G şırınga iğnesi yerleştirilmesi ve yavaş yavaş tampon uygulayarak. Tamponlar yapabilirsinizsuyu, ≤ 200 mM sukroz, ≤ 1 M sorbitol ve ≤ 5 mM HEPES. 10'dan fazla mM tuz solüsyonu alternatif electroformation gerilim protokolleri gerektirebilir. ~% 10 de aşırı dolmasına her conta.
- Not: bir kez lipidler sulu olan, lipid filmler hemen tabakalara ayırmak başlar bu yana, kalan adımları arasından hızla devam edin. Electroformation hemen başlarsa verim ve boyut maksimize edilir.
- Tek bir hareketle, conta en üstüne, ikinci bir İTO slayt, iletken yüz uygulayın. Conta alanı dışında ve ilk çıkıntı karşı çıkıntı en az 5 mm olduğundan emin olun. Iyi bir sızdırmazlık sağlamak için hafifçe bastırın.
- Etanol kullanarak iki çıkıntılar temizleyin ve conta bakan tarafı da multimetre ile iletken olduğundan emin olun.
- Istenirse oda daha parafilm veya hafif çekme yay klipleri ile güvence altına alınabilir.
- , "EMI gask alüminyum veya bakır çubuklar güvence altına alarak bir gerilim kaynağına electroformation odası bağlayıniki slaytların iletken yüzeylere et köpük "ya da iletken yapışkanlı bant. Biz EMI conta köpük kullanın. bir jig ve kelepçe için planlar Şekil 5'te gösterilmiştir.
- Hiçbir elektrik kişiler arasında kısa ve temas multimetre kullanarak, İTO yüzeylere doğru bağladığınız olduğunu doğrulayın.
- ° C, en az 10 ° C ila 42 ° C arasında erime sıcaklığı zinciri üzerinde 52 ısı, DPPC örneğin, bölme 10 ° C ila lipidlerin herhangi bir en yüksek erime sıcaklığının üzerinde mevcut ısı
- Düşük tuz tamponlar için, 60-90 dakika süreyle 10 Hz sinüs dalgası, iki İTO kaplı yüzey arasında her milimetre boşluk için ~ 0.7 V rms, geçerlidir. Yüksek tuz tampon için, diğer gerilim protokolleri (bkz. referanslar) kullanılmalıdır.
5. Görüntüleme ve Sorun Giderme
- Resim Rodamin veya Texas Kırmızı boyalar için bir filtre küp ile donatılmış ters bir mikroskop kullanarak lipozom. Lipozom, küresel olmalıdırağırlıklı olarak gözle unilamellar ve bu lipozom asılı "dizeleri" olarak arızaları.
- Lipozomlar çok küçük ise, daha az yağ kullanır.
- Birçok kusur ya da birkaç lipozomlar vardır, bu jel faz lipidler bağlı olabilir. Electroformation sıcaklığı yükselterek düşünün.
- Az ya da hiç dev lipozomlar susuz küçük lipozomlar tüm oluşan halinde, lipozom tampon ozmotik gücü azaltmak veya electroformation tampon ozmotik gücünü artırmak. Konsantre interstisyel tampon çözeltisi içine bir tamponun kalkış biriken lipid filmi arasında delaminasyona yol açabilir.
- Vezikül verim, kalite, ya da boyutu zayıf ve electroformation veya lipozom tampon tuzları veya pH tamponları dahil ise, alternatif electroformation gerilim protokolleri düşünün. Örneğin, Pott, et al. 11, 90 dakika boyunca bekletilmesi, 50-1,300 Vss / m 30 dakikadan fazla olan voltajı yükselterek, 500 Hz sinüs kullanarak üç adımlı bir protokol tavsiyen 30-60 dakika boyunca 50 Hz frekans azalan. Platin ya da titanyum elektrotlar, bu durumda gerekli olabilir, ancak bu büyük ölçüde protokol değiştirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim örneklerde, yaklaşık 55 mol% POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-fosfokolin),% 15 mol POP (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-fosfoserin karışımından lipozomların hazırlanması , 30% mol kolesterol ve% 0.1 mol Teksas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamin (DPPE-TxR) Kırmızı-etiketli. Bu bileşim, 18 Dorsal kök ganglion lipidlerin yaklaşık Örnek olarak seçildi. Biz% 15 mol olacaktır dikkat Lipid (buradan çıkar) (örneğin Walde ve ark. 4) electroformation kullanılabilir ne sınırına yakındır.
Hidroliz ve peroksidasyonu ile lipid arıza birçok lipid karışımları ve çok hassas deneyler (Tartışma) için özellikle önemli bir konudur. Tek başına netlik için, video sunumu inert gaz ortamlarında kullanmayın. Aşağıdaki şekiller, açıkça görüleceği gibi, bu fark ya da lipozomlar kalitesini etkileyebilir, ancak önemli çalışmalar için etmezyüksek doymamış yağlar kullanırken bunu lipid arıza önlemek için önemlidir.
Electroformation en önemli engel kurutulmuş önemli olduğunda lipid filmi nasıl olması gerektiğini bilerek, İndiyum-Kalay Oksit (İTO) yüzey üzerinde iyi bir lipid film oluşturmak olduğu için. Ancak, electroformation başarısız olduğunda, genellikle kayda değer dev lipozom üretimi ile sonuçlanan, bu yüzden tamamen yok. Sık sık, önemli döküntü görülecektir, bu genellikle çok fazla yağ kullanılmıştır gösterir. Bizim rakamlar bir başarısı üzerine görmek için beklediğini gösterir.
Şekil 2, kloroform çökelmiş lipidlerden electroformed lipozomlar iki farklı yamalar gösterir. Sol panelde, yakından oklar 2 ve 3 ile gösterilen yamalar inceleyin. Ok 2 kötü ayırt lipozomlarla bir yama işaret ederken, hiçbir lipozomlar ok 3 ile gösterilen bölgede odak haline getirilebilir. Birlikte, bu bulgular genel olarak kötü işaretçok fazla lipid olmak var muhtemelen nedeniyle hazırlık, bu alanda yatırılır. Sağ panelde, bu "bulanık" bölgeleri genel olarak daha iyi bir hazırlık gösteren, daha az yaygındır. Biz tamamen bu kusurları ortadan kaldırmak için nadir olduğunu bulmak.
Şekil 3 başarıyla lipidler gelen electroformed lipozomlar, iki büyütme, küçük lipozom dehidratasyon tarafından yatırılan Texas Red Epifloresans kullanarak görüntülü gösterir. Lipozomlar seyrek, ama birkaç iyi örnekleri vardır. Boyutu değişir çünkü, birkaç odak dışında. Oklar 40x büyütme resimde gözüken ikisi ~ 5-20 mikron, büyüklüğü arasında değişen üç kaliteli lipozomlar gösterir. Kenarında açık "halka" Not: Bu bir tek katmanlı veya hemen hemen tek katmanlı lipozom gösterir. Lipid bazı noktalar lipid çöktü veya oluşmuş hiç görünüyor olsa da, bu kaliteli bir sonucudur.
Son olarak, bu protokol geliştirme ve yayınlama amacımızGeleneksel patch-clamp elektrofizyoloji için uygun olan, sağlam, işlevsel memeli iyon kanalları GUVs hazırlamaktır. Şekil 4 biz bu protokolü kullanarak oluşturulan GUVs eksize lipid membran yamalar kaydedilen kapsaisin ile aktive TRPV1 iyonik akımları göstermektedir. Mevcut Rutenyum kırmızı ile bloke edilebilir, ve kapsaisin araç (% 0.1 etanol, 138 mM NaCI, 3 mM HEPES pH 7.4) ile tek başına aktif değildir. Elektrofizyoloji deneyleri için proteoliposomes hazırlanması kadar mevcut protokol kapsamı dışındadır, ancak gönderilen yazının konusudur.
| Tuz | Molalite @ 20 ° C ve doygunluk | % RH @ 10 ° C | % RH @ 20 ° C | % RH @ 30 ° C |
| Magnezyum Klorür Hexahydrate | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| Potasyum Karbonat Dihidrat | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| Sodyum Bromür | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Bakır klorid | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| Sodyum klorür | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| Potasyum Klorür | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
Tablo 1. Birkaç ortak tuzlarının Bağıl nem (% RH) Greenspan 19 ve Rockland 20 Bağıl nem verileri,. Uluslararası Kritik Tablolar 21 doygunluk veri.
Şekil 1. Küçük lipozomlar gelen dev lipozom electroformation şematik. (Sol üst) Küçük lipozomlar küçük damlacıklar bir dizi yatırılır, <5 ul. (Üst orta) lipozomlar bir doymuş tuz çözeltisi üzerinde kapalı bir kapta yerleştirerek kontrollü bağıl nem altında susuz. Bir higrometre isteğe bağlıdır. Lipid yapışkan bir film için (sağ üst) sonra kurutulmuş ve (muhtemelen) sorbitol gibi osmoticant, lipidler (protokol bkz. Bölüm 5) bir hiperosmotik tampon rehidrate vardır. (Sol alt) electroformation odasının üstünde ikinci bir İTO slayt ile mühürlenir. (Sağ alt) Son olarak, bölme lipit zincirinin erime sıcaklığının üzerinde ısıtılır ve iki İTO slayt boyunca salınımlı bir elektrik alanı temin bir sinyal kaynağına bağlanır.
Şekil 3,. Electroformed dev lipozomlar dehidratasyon-tevdi lipidler. (Sol) 10x büyütme anda oluşan, birkaç lipozomlar görülebilir. Üç lipozomlar etiketlenir. Aynı ile 40x büyütme sol olarak (sağ) aynı görünümü,lipozomlar (2 ve 3) etiketli. Bu lipozomlar sayısı genellikle solvent yatırılan lipid gelen elektro zaman çok daha küçüktür, ama birçok amaç için tamamen yeterli. Chroma 41004 Texas Kırmızı filtre küp ve Stanford Fotonik XR/MEGA-10 S30 yoğunlaştırılmış CCD kamera ile donatılmış bir ters Epifloresans mikroskop kullanılarak görüntülendi. 
Şekil 4. Bir GUV eksize bir membran yama kaydedilen cari kapsaisin aktif TRPV1 bu protokolü kullanarak kurdu. A. kaçak akım kapsaisin eklendi önce 500 MQ direnç mühür belirtti. B. doyurarak kapsaisin (> 20 mcM,% 0.1 etanol) aktive bir büyük TRPV1 akım;. mevcut Ruthenium Kırmızı tarafından bloke edilir, ve (veriler gösterilmemiştir) tek başına (tampon% 0.1 etanol) araç tarafından aktif değil C. Geçerli dönerkapsaisin yama dışında yıkanır gibi temel near. 
Şekil 5,. Electroformation odası için planlar. Dahil tam montaj gösteren, bilgi verir, ve üst ve alt plastik parçalar için şemaları boyutlu. Akrilik veya başka kolayca işlenmiş şeffaf plastik kullanın. İnce Kapton film ısıtıcı sıcaklık kontrol (özel reaktifler ve ekipman Tablo) bağlı olmalıdır, ve EMI conta köpük sinüs dalga sinyali iki İTO kaplı slayt boyunca uygulanır, böylece fonksiyon jeneratör bağlanmalıdır. Bir delik, bir sıcaklık probu için sağlanır. Flathead 10-32 vida alt parça gömme deliklere yerleştirilir ve üst parça ile geçmektedir. 10-32 fındık düzeneğini sabitlemek için kullanılır. Ne zaman tam olaraksembled, üst ve alt plastik parçalar iki taraf (paralel EMI conta için. taraf) birbirleriyle aynı hizada olmalıdır büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dev lipozomlar Electroformation çeşitli lipitler, preparatları ve tamponlar ile uyumlu esnek bir yöntem haline gelmiştir. Lipit birikmesini sürecin dikkatle kontrol başarısı için çok önemlidir. Biz küçük lipozom preparatları basit bir süreçten lipidlerin kontrollü birikimi yapmak için basit araçlar sunduk. Nispi nem ilk lipozomlar uygun dehidrasyon için kritik olan, ve en iyi değeri lipozom süspansiyonu, katıların başlangıç konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. Düşük bağıl nemi yeterli düzeyde daha konsantre örnekler kurutmak için gereklidir.
Electroformation için kullanılan tam hidrasyon protokolü ve elektrik alan tartışma 1,4,7,10,11,22 bir noktası olmaya devam etmektedir. Basit protokolü yüksek tuz konsantrasyonlarında, yüklü lipidler veya yüksek erime çok yüksek konsantrasyonlarda varlığında lipozom electroformation başlamadan önce ilk hakim olmalıdırsıcaklık lipidler ing. İlk şişlik, büyüme ve dekolmanı: bu becerileri hakim sonra, daha gelişmiş protokolleri genellikle üç bölüme electroformation süreci bölün. İlk şişme yavaş yavaş uygulanan elektrik alanı 11 artırarak tercih gibi görünüyor. Sabit alan güçte ikinci bir, isteğe bağlı aşama lipozomlar son boyutunu kontrol etmenize yardımcı olabilir. Son olarak, salınan alanın sıklığı azalan İTO yüzeyinden lipozomlar ayırmak için yardımcı olabilir. Yüksek frekanslarda fizyolojik tuz koşullarında 11 lipozomlar Electroform için ihtiyaç vardır, ancak lipozomlar alan frekansları ve büyüklükleri 10 çok geniş bir aralığı üzerinde oluşturulabilir.
Dev lipozomlar bir hipo-ozmotik tampon 7 ile susuz lipozomlar rehidrasyon üzerine kendiliğinden oluşturacak gözlem başarının birkaç anahtar gösterir. İlk olarak, lipozom şişme işlemi böylece electroformation, bazı, hemen başlargruplar bile lipid filmi 10 rehidrasyon önce AC elektrik alanı uygulamak için yararlı bulduk. İkincisi, sıvı akışı lipozomal şişme işlemi sürücüler olasıdır ve bu electroformation en az çünkü elektro-ozmotik tahrik akışının bir parçası olarak ortaya çıkar. Bu yerlerde electroformation 10 olarak kullanılabilir yararlı frekans ve genlik aralığı sınırlar.
Son birkaç yıl içinde tartışma bir önemli nokta lipid hidroliz ve peroksidasyonu 23,24 potansiyeli olmuştur. Her türlü lipid bozulmaya karşı ilk savunma GUV hazırlanmasında kullanılan tüm malzemeler oksijen kaldırmaktır: peroksidasyonu moleküler oksijen 23 bağlı olduğundan, bu önemli süreci yavaş olmalıdır. Inert gaz ile vakum ve sıyırma bir kombinasyonu mümkündür 15-17 kadar oksijenin çıkarılması için kullanılmalıdır. Sonikasyon ve hafif vakum etkisizdir. Biz v bir oksijen test kiti (Chemetrics K7501) kullanınmümkün olduğunca iyice oksijen kaldırdık ki erify. Hidroliz zararlı daha fazla, ama nötr pH 25, muhafaza 24 tarafından ve electroformation kullanılan gerilimini düşürerek azalır. Bazı yazarlar İTO yerine titanyum elektrotların kullanımı 23,24,26,27 kayar savunmaktadır. Geçmişte lipozom deneyler 28,29 müdahale bilinmektedir beri Biz, titanyum (ya da herhangi bir metal) ile örnekleri kontamine olasılığını önlemek için tercih, ancak bazı peroksidasyonu veya hidroliz etkileri önlemeye yardımcı olabilir. Bu yüksek sıcaklıklara uzun süre maruz lipid arıza 30 hızlandırır olduğunu söylemeye gerek yok. Son olarak, ince-tabaka kromatografisi 24,31, kolorimetrik tahlilleri 23 ve diğer yöntemler 31 lipit bozulma ölçmek için vardır.
Benzer bir sorun, özellikle yanal faz ayrılması 30,32 çalışmaları için, resim GUVs için kullanılan floresan lipit boyalarla ilgilidir 30,33 dikkatle seçilmelidir, ve en az konsantrasyonda kullanılmıştır.
Biz İTO elektrot slaytlar yeniden kullanılabilir konusunda herhangi bir fikir birliği farkında değildir. Bazı yok ederken Birçok grup, kendi İTO slaytlar yeniden yapmak. Son çalışmalar slayt zaman içinde aşağılamak yapmak olduğunu gösterir, ancak yüksek performanslı 34 yeniden kazanmak için tavlanmış olabilir, bu bozulma zvitteriyonik veya anyonik lipidler dahil olmak üzere lipid karışımları için sadece küçük bir etkisi vardı, ama katyonik lipidler içeren karışımlar için önemliydi. Biz tavlama olmadan slaytlar yeniden.
Dev lipozomlar, teorik anlayış ve tekniği ile pratik deneyim Electroform için kullanılan protokollerde büyük farklılıklar olmasına rağmen sürekli geliştirmektedir. Zaten lipozomlar yüklü lipidler veya yüksek tuz tamponları büyük miktarlarda sahip olacak şekilde oluşturulabilir. Anahtar hangi, elektrot yüzeyinde lipidlerin verimli birikimi kalırh bizim protokol çekirdeğidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz electroformation cihazı oluşturmak için Bryan Venema ve Eric Martinson teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Ulusal Bilimler Enstitüleri hibe (SEG için R01GM100718) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü (SEG için R01EY017564) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
